DB32T 1730-2011 養(yǎng)殖水體細(xì)菌總數(shù)測定-熒光顯微計數(shù)法　

備案號：DB32江蘇省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB32/T1730—2011本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》給出的規(guī)則編寫。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A為資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由江蘇省海洋與漁業(yè)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：江蘇省淡水水產(chǎn)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：楊鳶劼、陳大鵬。DB32/T1730—2011養(yǎng)殖水體細(xì)菌總數(shù)測定--熒光顯微計數(shù)法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了熒光顯微計數(shù)法測定養(yǎng)殖水體細(xì)菌總數(shù)的試劑、儀器設(shè)備、操作步驟、計數(shù)方法和計算。本標(biāo)準(zhǔn)適用于養(yǎng)殖水體細(xì)菌總數(shù)的測定，也適用于環(huán)境水域。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T4789.28食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗、染色法、培養(yǎng)基和試劑GB/T6682分析實(shí)驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T18088出入境動物檢疫采樣3原理細(xì)菌組織細(xì)胞經(jīng)陽離子熒光探針--吖啶橙（AcridineOrange，AO）熒光色素染色后，以嵌入或靜電吸引與蛋白DNA/RNA相結(jié)合。在生物熒光顯微鏡高壓汞燈發(fā)射光譜激發(fā)光下（200~600nm活菌細(xì)胞和受損細(xì)胞（死細(xì)胞）分別產(chǎn)生黃綠色到綠色熒光和橙色到紅色熒光。鏡檢計數(shù)待檢樣品中活菌細(xì)胞和死菌細(xì)胞數(shù)，同時也可以計數(shù)總菌數(shù)。4試劑所用試劑除特別說明外，藥品均為分析純(AR)。無菌水均為經(jīng)0.2μm濾膜過濾的雙蒸去離子4.1甲醛溶液(40%)4.2萘啶酮酸溶液（0.002%）萘啶酮酸（C12H12N2O3）0.002g無菌水100mL待萘啶酮酸充分溶解后，經(jīng)0.2μm濾膜過濾滅菌，置滅菌試劑瓶室溫保存。4.3酵母膏溶液（0.025%）酵母膏（生化試劑）0.025g無菌水100mL將酵母膏在無菌水中加熱，充分溶解后，經(jīng)0.2μm濾膜過濾滅菌，置滅菌試劑瓶室溫保存。4.4氫氧化鈉溶液（4%）氫氧化鈉（NaOH）無菌水DB32/T1730—20114.5磷酸鹽緩沖液（pH7.2±0.05）磷酸二氫鉀（KH2PO4·2H2O）34g無菌水500mL待磷酸二氫鉀充分溶解后，用NaOH溶液調(diào)整pH7.2±0.05，4℃保存。4.6吖啶橙染色溶液（0.1%）磷酸鹽緩沖液（pH7.2±0.05）100mL將吖啶橙和磷酸鹽緩沖液混合，充分溶解后，經(jīng)0.2μm濾膜過濾滅菌，置滅菌棕色試劑瓶，室溫保存，有效期6個月。操作時需戴手套。4.7蘇丹黑B溶液蘇丹黑B（C29H24N6）無水乙醇（C2H6O）無菌水75mL75mL將蘇丹黑B在乙醇中充分溶解后，再與無菌水混合，經(jīng)0.2μm濾膜過濾滅菌，置棕色試劑瓶暗處保存，有效期6個月。4.80.5mol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.0～9.5)碳酸氫鈉（NaHCO3）3.7g碳酸鈉（Na2CO3）0.6g無菌水600mL將碳酸氫鈉和碳酸鈉在無菌水中充分溶解后置試劑瓶，密封保存。4.9緩沖甘油封片劑碳酸鹽緩沖液(pH9.0-9.5)10mL無熒光甘油（C3H8O3）90mL按比例將碳酸鹽緩沖液和無熒光甘油在攪拌器上充分混勻后4℃保存，待氣泡排除后方可使用。4.10無熒光顯微鏡物鏡鏡油TypeFF（Nd=1.516）5儀器及設(shè)備5.1熒光顯微鏡，具落射汞燈裝置、攝像轉(zhuǎn)換器及監(jiān)視器,濾光片組：450～490nm激發(fā)，520nm屏障，目鏡（10×),油鏡物鏡（100×)。5.2電子天平：感量0.0001g。5.4超凈工作臺。5.5高壓滅菌鍋。5.6采樣瓶，50mL螺蓋聚丙烯塑料瓶。5.7醋酸纖維濾膜：?25mm，孔徑0.22μm。5.8過濾器（包含抽濾管）。5.9量筒（容量20mL）。5.10鑷子（平頭）。5.11酒精燈。5.12載玻片：25.4mm×76.2mm(長×寬)，厚0.80mm。5.13蓋玻片：18.0mm×18.0mm(長×寬)，厚0.17mm。3DB32/T1730—20116測定步驟6.1準(zhǔn)備6.1.1采樣瓶使用前用5%HCl溶液浸泡1h以上，0.2μm濾膜過濾的雙蒸去離子水漱洗。6.1.2采樣瓶密閉包裝后置高壓滅菌鍋，1.05kg/cm2（121.3℃),保持20min，冷卻后，無菌室保存?zhèn)溆谩?.1.3醋酸纖維濾膜用蘇丹黑B溶液浸泡24h，消除濾膜自發(fā)熒光。6.1.4處理過的醋酸纖維濾膜平整放置于濾器底座。6.1.5安裝過濾器和抽濾管，用經(jīng)過處理的無菌水加滿抽濾管，緩慢抽濾清洗3次后，備用。6.2樣品處理6.2.1取待檢水樣50mL于滅菌采樣瓶中，采樣時不需要水樣沖洗采樣瓶。6.2.2如果待檢水樣不能立即進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)，可在水樣中加入1:20（V:V）甲醛溶液，至甲醛終濃度為2%，可在4℃保存1個月。6.3水樣檢測制片制備6.3.1取固定后的水樣1mL，使用抽濾裝置，緩慢釋放真空過濾。6.3.2無菌吸取吖啶橙染液3mL，充分覆蓋濾膜，緩慢釋放真空過濾染色3~5min。6.3.3移走濾器，空氣干燥15s，用滅菌鑷子取下濾膜。6.3.4在潔凈的載玻片上加1小滴無熒光鏡油，貼上濾膜，濾膜載菌面朝上。6.3.5在蓋玻片上加1小滴無熒光鏡油，具油面朝下蓋緊濾膜，用鑷子輕壓蓋緊濾膜，濾膜上下兩面放置不能有氣泡。6.3.6用封片劑將蓋玻片4周封固，用于計數(shù)。如不能立即計數(shù)，可將制片在-20℃條件下保存2~36.4計數(shù)和結(jié)果判斷6.4.1使用落射光熒光顯微鏡，藍(lán)色激光道，紫外光波長450nm。6.4.2鏡檢計數(shù)視野中的熒光菌體，發(fā)黃綠色到綠色熒光為活菌體細(xì)胞，發(fā)橙色到紅色熒光為死亡菌體細(xì)胞。6.4.3計數(shù)10個隨機(jī)視野，每個視野菌數(shù)為50~300cells為好，求平均值。若視野中菌數(shù)遠(yuǎn)大于300cells，則將待檢水樣用生理鹽水稀釋后重新過濾染色，再進(jìn)行計數(shù)。6.4.4每次測定計數(shù)時，應(yīng)使用無菌水為陰性對照，作為控制樣品處理過程中污染進(jìn)入的顆粒干擾，每個視野不得出現(xiàn)1個以上細(xì)菌。依據(jù)樣品中細(xì)菌菌落計數(shù)，按下式(1)計算每升水樣中的細(xì)菌菌落總數(shù)。BN—樣品含菌數(shù)，單位為個每升（cells/LNa—各視野平均菌數(shù)，單位為個（cellsS—濾膜實(shí)際過濾面積，單位為平方毫米（mmSf—顯微鏡視野面積，單位為平方毫米（mm V—過濾樣品量，單位為升（LDB32/T1730—20118注意事項8.1水體和溶液中的細(xì)菌或其他熒光顆?？筛蓴_計數(shù)的準(zhǔn)確性，除待檢測樣品外，其他測定過程中使用的試劑和溶液都應(yīng)當(dāng)用0.2μm濾膜過濾，所有玻璃器皿都須用0.2μm濾膜過濾后雙蒸去離子水沖洗。8.2熒光顯微鏡藍(lán)色激發(fā)光道、油鏡條件下，病毒顆粒呈針扎狀、亮綠色，細(xì)菌細(xì)胞亦呈亮綠色，但其亮度強(qiáng)于病毒顆粒，且菌體比病毒顆粒大得多。8.3每次測定計數(shù)時，使用無菌水為陰性對照，控制樣品處理過程中污染進(jìn)入的顆粒干擾，每個視野不得出現(xiàn)1cell以上細(xì)菌。8.4因二甲苯能自發(fā)熒光，封片劑和物鏡清潔絕不能使用二甲苯。8.5開啟汞燈后，不可立即關(guān)閉，一次工作最少15～20min，燈熄滅后要等待30min，完全冷卻后才能重新啟動。5DB32/T1730—2011《養(yǎng)殖水體細(xì)菌總數(shù)測定--熒光顯微計數(shù)法》6DB32/T1730—2011平上的各種生命現(xiàn)象，超出了組織細(xì)胞的概念。組織細(xì)胞經(jīng)熒光色素染色后，因DNA和RNA分子