DB32T 1775-2011 I型鴨肝炎病毒的檢測(cè)RT-PCR 方法　

ICS65.020.30備案號(hào)：DB32I型鴨肝炎病毒的檢測(cè)RT-PCR方法MethodofRT-PCRdetectin江蘇省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB32/T1775—2011為規(guī)范I型鴨肝炎病毒分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，提高鴨肝炎病毒檢測(cè)的靈敏度、穩(wěn)定性、特異性，特制定本標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)結(jié)構(gòu)和編寫(xiě)》編制。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A為規(guī)范性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。本標(biāo)準(zhǔn)起草人：魏雪濤、李銀、劉宇卓、張敬峰。1DB32/T1775—2011I型鴨肝炎病毒的檢測(cè)RT-PCR方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范了I型鴨肝炎病毒分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)RT-PCR的所用引物大小、所涉及的樣品范圍、操作流程、反應(yīng)條件等技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于檢測(cè)鴨肝臟和病毒尿囊液中I型鴨肝炎病毒核酸。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法NY/T541-2002動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)采樣3方法原理聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction)，簡(jiǎn)稱PCR，是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。PCR技術(shù)卻以其快速、敏感和特異等優(yōu)點(diǎn)在動(dòng)物疫病檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用，而且隨著PCR技術(shù)的不斷改進(jìn)，這種針對(duì)病原核酸的診斷方法表現(xiàn)出更準(zhǔn)確、靈敏和特異的特點(diǎn)。本標(biāo)準(zhǔn)選取了DHVIVP1基因的保守，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，經(jīng)過(guò)了PCR條件的優(yōu)化、特異性實(shí)驗(yàn)、敏感性試驗(yàn)等，對(duì)DHVI的鑒定具有很高的準(zhǔn)確性。4儀器設(shè)備和主要試劑4.1儀器設(shè)備：PCR儀，離心機(jī)，電泳槽，微量移液器，凝膠成像系統(tǒng)4.2主要試劑：TRIZOL，氯仿，異丙醇，無(wú)水乙醇，焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的滅菌雙蒸水，AMV反轉(zhuǎn)錄酶，5×AMVBuffer，10mmol/LdNTPs，RNA酶抑制劑，25mmol/LMgCl2，EXTaqDNA聚合酶，10×EXTaqDNA聚合酶buffer，2.5mmol/LdNTP，DNAMarkerDL-2000，瓊脂糖。上游引物：5′-ATCTAATGTCCCGATACAAGGTG-3′；下游引物：5′-ACGCTAGTGTTTTGAGTCTAAGGC-3′。6樣品采集按照NY/T541-2002動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)采樣方法，病死或撲殺鴨，無(wú)菌采集肝臟組織。7方法步驟2DB32/T1775—2011試驗(yàn)用水：按照GB-T6682-2008三級(jí)水標(biāo)準(zhǔn)7.1樣品處理取病料0.5g～1g置研缽中剪碎并研磨，反復(fù)凍融研磨，將研磨好的組織，用生理鹽水1︰5稀釋?zhuān)?℃12000r/min離心10min，取上清200μL備用。陰性對(duì)照：沒(méi)有發(fā)病的正常鴨肝臟陽(yáng)性對(duì)照：用中和試驗(yàn)檢測(cè)DHV陽(yáng)性肝臟樣品（見(jiàn)附錄A）7.2DHVRNA的提取取已處理的待檢樣品，以DHV陽(yáng)性病毒為陽(yáng)性對(duì)照，以正常肝臟作為陰性對(duì)照，無(wú)菌水為空白對(duì)照，每管依次加入Trizol600μL，振蕩混勻后，室溫放置10min，加入氯仿200μL，劇烈振蕩后，室溫放置1min，4℃12000r/min，離心15min，取上層水相750μL，加入500μL異丙醇，混勻，﹣20℃放置15min，4℃12000r/min,離心15min，去上清，緩緩加入75%乙醇1mL洗滌，4℃8000r/min離心5min，去上清，室溫干燥RNA樣品沉淀20min，加入DEPC水10μL，使充分溶解。7.3RT-PCR反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：5×AMVBuffer4μL、10mmol/LdNTPs2μL、下游引物1μL、RNA酶抑制劑0.5μL、RNA模板10μL，AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.5μL，H2O（DEPC處理）2μL，總體積為20μL，瞬間離心混勻，65℃反應(yīng)15min，42℃孵育1h，95℃5min，同時(shí)設(shè)立陰性、陽(yáng)性對(duì)照，產(chǎn)物于﹣20℃保存?zhèn)溆谩?PCR的反應(yīng)：按25μL體系進(jìn)行，含MgCl2（25mmol/L）1.5μL，滅菌水15μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物4μL，10×EXTaqDNA聚合酶buffer2.5μL，2mmol/LdNTP0.5μL，上、下游引物50pmol/μL各0.5μL，EXTaqDNA聚合酶0.5μL。94℃3min，然后進(jìn)入循環(huán)94℃30s，52℃30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)，于72℃延伸10min，4℃保存。7.4結(jié)果觀察將PCR反應(yīng)產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電壓為120V，時(shí)間30min，紫外燈下觀察結(jié)果，并進(jìn)行拍照。8結(jié)果判定在陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)相應(yīng)擴(kuò)增帶、陰性對(duì)照無(wú)此擴(kuò)增帶是判定結(jié)果。檢測(cè)樣品出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照相同目的條帶大小為365bp的擴(kuò)增片段是，判定為該樣品為I型鴨肝炎核酸陽(yáng)性；否則判定維陰性。如果陽(yáng)性對(duì)照無(wú)相應(yīng)的目的條帶，可能是存在操作失誤，該試驗(yàn)需要做重復(fù)試驗(yàn)；如果陰性對(duì)照有相應(yīng)的目的條帶，可能是陰性對(duì)照存在污染或是操作失誤，該試驗(yàn)需要做重復(fù)試驗(yàn)。3DB32/T1775—2011(規(guī)范性附錄)陽(yáng)性樣品的制備用中和試驗(yàn)檢測(cè)DHV陽(yáng)性肝臟樣品，陽(yáng)性樣品按如下方法制備：首先，無(wú)菌采集新鮮DHV陽(yáng)性鴨肝臟，用無(wú)菌的剪刀剪碎并稱量，然后以質(zhì)量比1∶5加入DEPC（diethypyrocarbonate焦碳酸二乙酯）水，研磨成懸液，裝入用DEPC處理過(guò)的離心管中，于﹣20℃反復(fù)凍融3次，以12000r/min，冷凍離心20min，取上清接種