DB32T 3274-2017 紫甘薯種苗病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.20B23備案號(hào)：54543-2017DB32TechnicalregulationforvirusdetectionofPurple-fleshedsweetpotatoseedlings--江蘇省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局IDB32/T3274—2017本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T1.1—2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》的要求編寫。本標(biāo)準(zhǔn)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：邊小峰、馬佩勇、賈趙東、謝一芝、郭小丁、禹陽(yáng)。1DB32/T3274—2017紫甘薯種苗病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)程本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了紫甘薯種苗的質(zhì)量要求和檢測(cè)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于紫甘薯種薯（苗）繁育、生產(chǎn)、銷售過程中的質(zhì)量鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4406-1984種薯GB7413-2009甘薯種苗產(chǎn)地檢疫規(guī)程N(yùn)Y/T402-2016脫毒甘薯種薯（苗）病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)程N(yùn)Y/T1200-2006甘薯脫毒種薯3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用本文件。3.1甘薯種苗sweetpotatoseedlings從育種家種子開始，經(jīng)逐代繁殖增加種薯（苗）數(shù)量的種薯生產(chǎn)體系生產(chǎn)出來的種薯（苗）。分為育種家種子、原原種、原種、生產(chǎn)用種四個(gè)級(jí)別。3.2育種家種子breeder’sseed由育種者直接生產(chǎn)和掌握的原始種子，具有該品種的典型性和遺傳穩(wěn)定性，純度100%，不帶病毒和其他病蟲害，產(chǎn)量及其他主要性狀符合推廣時(shí)的原有水平。3.3原原種pre-elite用育種家種子或典型品種的脫毒試管苗在防蟲網(wǎng)室、溫室條件下生產(chǎn)的符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的種薯（苗）。3.4原種elite用原原種作種薯，在良好隔離條件下生產(chǎn)的符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的種薯（苗）。2DB32/T3274—20173.5生產(chǎn)用種certifiedseed用原種作種薯，在良好隔離條件下生產(chǎn)的符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的種薯（苗）。4縮略語甘薯羽狀斑駁病毒（sweetpotatofeatherymottlevirus,SPFMV）。甘薯潛隱病毒（sweetpotatolatentvirus,SPLV）甘薯褪綠斑病毒（sweetpotatochloroticfecksvirus,SPCFV）5質(zhì)量要求各級(jí)別種薯（苗）繁殖田中帶病植株允許率應(yīng)符合表1的要求。表1各級(jí)別種薯（苗）繁殖田中允許病毒檢出率(%)種薯級(jí)別育種家種子原原種原種生產(chǎn)用種0000006檢測(cè)方法6.1檢測(cè)樣本的選擇6.1.1脫毒試管苗對(duì)每個(gè)單株進(jìn)行檢測(cè)。淘汰帶毒單株，經(jīng)檢測(cè)確定無病毒的才繼續(xù)擴(kuò)繁。6.1.2育種家種子、原原種和原種于苗期、封壟前和收獲前2周，在目測(cè)全田，淘汰顯癥苗的基礎(chǔ)上，采用隨機(jī)取樣法，抽樣數(shù)量為：面積小于等于0.1hm2，檢驗(yàn)2點(diǎn)，每點(diǎn)100株；面積大于0.1hm2小于等于1hm2，檢驗(yàn)5點(diǎn)，每點(diǎn)100株；超過1hm2面積，劃出另一檢驗(yàn)區(qū)，按本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定面積取樣。病毒檢測(cè)每株取莖蔓上、中、下部葉片各1片，24h內(nèi)檢測(cè)（見表2）。6.1.3生產(chǎn)用種于封壟前、收獲前2周，在目測(cè)全田，淘汰顯癥苗的基礎(chǔ)上，采用隨機(jī)取樣法，面積小于0.1hm2，檢驗(yàn)2點(diǎn)，每點(diǎn)100株；面積大于0.1hm2小于等于1hm2，檢驗(yàn)5點(diǎn)，每點(diǎn)100株；面積大于1hm2小于等于5hm2，檢驗(yàn)10點(diǎn)，每點(diǎn)100株；超過5hm2面積，劃出另一檢驗(yàn)區(qū)，按本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定面積取樣。取樣方法同原種。見表2。3DB32/T3274—2017表2各級(jí)別種薯（苗）繁殖田中在不同種植面積中的抽樣數(shù)量種薯級(jí)別育種家種子原原種原種生產(chǎn)用種hm22＜面積≤5hm26.2酶聯(lián)免疫檢測(cè)法當(dāng)單株苗展開葉達(dá)6片以上時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，按株取其上、中、下部葉片用于酶聯(lián)免疫檢測(cè)，剩余植株部分繼續(xù)生長(zhǎng)。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)法初檢后，淘汰顯陽(yáng)性反應(yīng)的單株。6.2.1樣品制備將待測(cè)葉片用清水清洗干凈，從每一樣品葉片上各取一直徑約1cm圓片，放入樣品袋中，加入3mL抽提緩沖液充分研磨，4℃靜置30min～40min，取澄清液點(diǎn)樣。樣品為塊根時(shí)，催芽處理后取幼芽、葉制樣。6.2.2檢測(cè)步驟6.2.2.1點(diǎn)樣將打好方格的硝化纖維素膜用TBS緩沖液處理后放在潔凈的濾紙上，每個(gè)樣品各吸取17uL上清液滴在膜上方格的正中，干燥15min～30min。同時(shí)設(shè)陽(yáng)性、陰性和空白對(duì)照，可根據(jù)需要設(shè)置重復(fù)。6.2.2.2封閉將干燥后的膜浸泡在封閉緩沖液中，室溫下?lián)u床振蕩1h(50r/min)。6.2.2.3孵育第一抗體及洗滌將膜置于用抗體緩沖液稀釋至工作濃度的抗血清中，室溫下?lián)u床振蕩過夜(50r/min)。用洗滌緩沖液洗膜3次，每次搖床振蕩3min(100r/min)。6.2.2.4孵育第二抗體將膜置于用抗體緩沖液稀釋至工作濃度的酶標(biāo)抗體中，室溫下?lián)u床振蕩1h(50r/min)。洗滌緩沖液洗膜3次，每次搖床振蕩3min(100r/min)。6.2.2.5顯色將膜置于NBT/BCIP底物溶液中，室溫下?lián)u床振蕩孵育30min(50r/min)。6.2.2.6終止反應(yīng)棄去底物溶液并用蒸餾水洗膜3次，每次搖床振蕩3min(100r/min)。6.2.2.7陽(yáng)性判斷4DB32/T3274—2017晾干后觀察顏色反應(yīng)，出現(xiàn)藍(lán)紫色反應(yīng)的樣品為陽(yáng)性。6.3指示植物檢測(cè)確認(rèn)通過酶聯(lián)免疫檢測(cè)法檢測(cè)的健康株繼續(xù)擴(kuò)繁，經(jīng)指示植物檢測(cè)，指示植物不顯癥的才能確認(rèn)為無毒種苗。經(jīng)檢測(cè)確認(rèn)的健康種苗繼續(xù)擴(kuò)繁。6.3.1材料準(zhǔn)備6.3.1.1將待檢測(cè)的脫毒苗或種苗盆栽于防蟲措施良好的溫室中。6.3.1.2盆播指示植物——巴西牽牛（Ipomoeasetosa），花盆直徑不小于10cm，每待檢測(cè)樣品及陽(yáng)性對(duì)照各需生長(zhǎng)健壯巴西牽牛5株。6.3.2嫁接巴西牽牛生長(zhǎng)出1片～2片真葉時(shí)嫁接，以待檢測(cè)樣品莖蔓為接穗，巴西牽牛為砧木。將待檢測(cè)樣品莖蔓中下部莖段切成3段～5段，每個(gè)接穗帶一個(gè)單芽及葉片，去葉后將底端削成楔形，插入巴西牽牛砧木切口內(nèi)，封口膜扎緊。嫁接后白天保持氣溫26℃~36℃,相對(duì)濕度80%～90%，適當(dāng)遮陰，嫁接成活后，給予充足光照。6.3.3陽(yáng)性判斷嫁接后2周～3周顯癥，在所有嫁接指示植物中只要有一株表現(xiàn)典型癥狀即為陽(yáng)性。癥狀為：SPFMVSPLVSPCFV羽狀斑駁葉脈變黃葉片褪綠斑5DB32/T3274—2017（資料性附錄）斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫檢測(cè)法（DOT-ELISA）所用試劑斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫檢測(cè)法（DOT-ELISA）所用試劑所用化學(xué)試劑為分析純級(jí)規(guī)格，用水為蒸餾水。A.1在羥甲基氨基甲烷（TBS）(pH7.5)TrisBase4.84g氯化鈉（NaCl）58.44g疊氮鈉（NaN3）0.40g溶于1990mL蒸餾水中，用鹽酸（37%）調(diào)pH至7.5，定容至2000mL。洗滌緩沖液（T-TBS）1.0mL吐溫-20（Tween-20）溶于2000mLTBS中。A.2抽提緩沖液亞硫酸鈉（Na2SO3）0.2g溶于TBS中，定容至100mL。A.3封閉緩沖液（現(xiàn)用現(xiàn)配）脫脂奶粉0.50g粹通X-100（TritonX1-00）0.5mLTBS25mL先將脫脂奶粉溶于少量TBS中，再用TBS定容至25mL。加入TritonX-100混合均勻。A.4抗體稀釋緩沖液脫脂奶粉1.00gTBS50mL先將脫脂奶粉溶于少量TBS中，再用TBS定容至50mL。A.5底物緩沖液（pH9.5）TrisBase6.05g氯化鈉（NaCl）2.92g氯化鎂（MgCl2·6H2O）0.51g疊氮鈉（NaN3）0.05g溶于450mL蒸餾水中，用濃鹽酸調(diào)pH至9.5，定容至500mL。6DB32/T3274—2017A.6硝基藍(lán)四唑鹽（NBT）和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯（BCIP）儲(chǔ)備液NBT儲(chǔ)備液：NBT0.04g70%N,N-二甲基甲酰胺1.2mL混合均勻，4℃避光保存。BCIP儲(chǔ)備