化學(xué)品 藻類生長抑制試驗 征求意見稿

1GB/T21805—XXXX化學(xué)品藻類生長抑制試驗本文件規(guī)定了化學(xué)品藻類生長抑制試驗的受試物信息、試驗原理、參比物、試驗方法、試驗程序、質(zhì)量保證與質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)與報告。本文件適用于評價具有低揮發(fā)性、高環(huán)境穩(wěn)定性且試驗條件下可溶于水的受試物對藻類生長的影響。如果要測試揮發(fā)性的、強吸附性的、有顏色的、不溶或難溶于水的受試物，以及可能影響培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)有效利用的受試物，需要對所述試驗程序進行修改（如密閉系統(tǒng)、試驗容器的適應(yīng)等）。2術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。2.1生物量biomass一定體積試驗溶液中活體生物的干重，例如每升試驗溶液中含多少毫克藻類干重。生物量通常被定義為質(zhì)量，但在本文件中，是指單位體積的質(zhì)量，同時，本文件中，通常測量生物量的替代參數(shù)，例如細胞數(shù)量、熒光等，因此術(shù)語“生物量”也指這些替代參數(shù)。2.2變異系數(shù)coefficientofvariation標(biāo)準(zhǔn)差與平均數(shù)之比，也可以百分比表示，記作CV%。變異系數(shù)是一個無量綱的數(shù)，因而便于樣本間的相互比較。對照組各平行試驗平均特定生長率變異系數(shù)的平均值按以下方法計算：1）通過試驗各階段對照組各平行試驗的生長速率，分別計算得出各階段的對照組各平行試驗平均特定生長率變異系數(shù)；2）將上述1）等到的所有數(shù)據(jù)進行平均，得出對照組各平行試驗平均特定生長率變異系數(shù)的平均值。2.3效應(yīng)濃度effectconcentration；ECx暴露期（或偏離完整或常規(guī)試驗周期，應(yīng)說明）內(nèi)，與對照組相比，引起受試生物生長下降x%（如50%）的受試物濃度。EC有基于生長率的ErC和基于生長量的EyC之分。2.4藻類生長培養(yǎng)基growthmedium藻類暴露于受試物時，其生長所基于的完全人工合成的培養(yǎng)介質(zhì)。通常將受試物溶于培養(yǎng)基（配制試驗液）。2.5生長率growthrate2GB/T21805—XXXX即平均特定生長率（averagespecificgrowthrate），是暴露期間生物量的對數(shù)增長。2.6最低可觀察效應(yīng)濃度lowestobservedeffectconcentration；LOEC一定暴露期內(nèi)，與對照相比，對藻類生長有明顯（p<0.05）抑制效應(yīng)的最低試驗濃度（受試物設(shè)置濃度）。高于LOEC的所有試驗濃度均可觀察到與LOEC相同的或更嚴(yán)重的毒性影響。如果未滿足該條件，須就LOEC（以及NOEC）的選擇進行詳細說明。2.7無可觀察效應(yīng)濃度noobservedeffectconcentration；NOEC緊臨并低于最低可觀察效應(yīng)濃度（LOEC）的試驗濃度（受試物設(shè)置濃度）。2.8反應(yīng)變量responsevariable用于估計毒性的變量，該變量源自通過不同計算方法描述生物量的任何測量參數(shù)。本文件中指生長率和生長量。2.9特定生長率specificgrowthrate暴露結(jié)束時生物量自然對數(shù)與暴露開始時生物量自然對數(shù)之差與試驗周期的商，以每天生物量的對數(shù)增長表示。2.10暴露結(jié)束時生物量與暴露開始時生物量之差，以反映試驗期間生物量的增長。3受試物信息3.1以下受試物信息對于確定試驗條件可能有用：a)結(jié)構(gòu)式；b)純度；c)光中的穩(wěn)定性；d)試驗條件下的穩(wěn)定性；e)吸光性；f)水解離常數(shù)（pKag)轉(zhuǎn)化方面的研究結(jié)果，包括水中的生物降解試驗結(jié)果。3.2以下受試物信息應(yīng)該已知：a)水中溶解度；b)正辛醇-水分配系數(shù)（POW）；c)蒸氣壓；d)試驗條件下有效的受試物定量分析方法，包括注明回收率和檢測限。4試驗原理3GB/T21805—XXXX本試驗的目的是確定受試物對淡水微藻和/或藍藻生長的影響。將呈指數(shù)增長的藻類通過分批培養(yǎng)，暴露于受試物。試驗周期通常72小時。盡管測試持續(xù)時間相對較短，但可以評估對藻類幾個世代的影響。與無受試物暴露的對照相比，暴露于不同濃度的受試物，藻類生長會受到不同程度的抑制，將生長抑制效應(yīng)作為暴露濃度的函數(shù)進行評估。測量藻類在營養(yǎng)充足、連續(xù)光照足夠長時間的條件下不受限制地呈指數(shù)生長時的特定生長率的降低，以充分表達受試物的毒性效應(yīng)（達到最佳靈敏度）。測量不同時間藻類的生物量，以量化藻類的生長和生長抑制。但因藻類干重難以測量，使用替代參數(shù)。在這些替代參數(shù)中，最常使用細胞計數(shù)。其他替代參數(shù)包括細胞體積、熒光、光密度等。測量的替代參數(shù)和生物量之間的換算系數(shù)應(yīng)該是已知的。測試終點為生長抑制，以試驗期間生物量對數(shù)增加（特定生長率）的降低來表達。根據(jù)一系列試驗濃度下的平均特定生長率，確定引起特定生長率降低達另一反應(yīng)變量是生長量，即暴露結(jié)束時生物量與暴露開始時生物量之差。根據(jù)一系列試驗濃度下的平均生長量，確定引起生長量降低達到x%（例如50%）的濃度并表示為EyCx（例如EyC50）。此外，可以統(tǒng)計得出最低可觀察效應(yīng)濃度（LOEC）和(或)無可觀察效應(yīng)濃度（NOEC）。5參比物3,5-二氯苯酚可作為參比物。對于綠藻，也可使用重鉻酸鉀作為參比物。定期測試參比物對藻類生長的影響，至少每年兩次。6試驗方法6.1儀器設(shè)備6.1.1試驗容器試驗容器和其他與試驗液直接接觸的器皿應(yīng)完全為玻璃或其他化學(xué)惰性材料制成，用于試驗前應(yīng)徹底清洗并滅菌。試驗容器通常為具有一定容積的玻璃瓶，如三角瓶，以保證試驗期間有足夠的試驗液用于測試，同時也保證CO2的充分交換。注意必須保證有足夠的液體用作分析測量。6.1.2培養(yǎng)設(shè)備使用溫度控制精度在±2℃范圍內(nèi)的光照培養(yǎng)箱。6.1.3照度計光照強度的測量方法非常重要，特別是光接受器的類型可能影響測量值。最好使用4π的球面照度計（可接受來自各方向各角度的直射或反射光照）或2π球面照度計（可接受來自上方各角度的直射或反射光照）。6.1.4測量藻類生物量的儀器設(shè)備細胞計數(shù)是藻類生物量最常用的替代參數(shù)。用于計數(shù)的儀器設(shè)備主要有電子顆粒計數(shù)儀、帶計數(shù)室的顯微鏡、流式細胞計數(shù)儀等。也可使用流式細胞計數(shù)儀、熒光計、分光光度計、色度計等測量其他替代參數(shù)。為了在低生物量時進行有效測量，分光光度計吸收池的光徑必須至少為4cm。應(yīng)明確替代參數(shù)和藻類干重之間的轉(zhuǎn)換關(guān)系。6.1.5其他儀器4GB/T21805—XXXX——pH計——電子天平——高壓滅菌器等6.2受試生物選擇一些不易附著于瓶壁上的綠藻和藍藻作為受試生物。a）綠藻——近頭狀尖胞藻（Raphidocelissubcapitata，曾用名：羊角月芽藻/Pseudokirchneriellasubcapitata）——近具棘鏈帶藻（Desmodesmussubspicatus，曾用名：柵藻/Scenedesmussubspicatus）——普通小球藻（Chlorellavulgaris）b）硅藻——舟形藻（Naviculapelliculosa）c）藍藻——水華魚腥藻（Anabaenaflos-aquae）——聚球藻（Synechococcusleopoliensis）上述藻類的詳細信息見附錄A。也可選用其他藻類，但應(yīng)在報告中說明其品系和（或）來源，并確保在試驗期間相應(yīng)的試驗條件下保持指數(shù)生長。6.3培養(yǎng)基使用OECD和AAP的藻類培養(yǎng)基，其組成見附錄B。注意兩種培養(yǎng)基的初始pH值和緩沖能力（調(diào)節(jié)pH值）不同，因此，所使用的培養(yǎng)基不同，測試結(jié)果可能會有所不同，尤其是當(dāng)受試物在水中離子化程度較高時。有時可能需要對藻類培養(yǎng)基進行修改，例如在測試金屬和螯合劑或在不同的pH值條件下測試時，這時應(yīng)詳細描述改良后培養(yǎng)基的使用并證明其合理性。7試驗程序7.1試驗準(zhǔn)備7.1.1藻液的制備為使受試藻類適應(yīng)試驗條件，保證藻類在用于接種試驗液時處于指數(shù)生長期，試驗開始前2-4天在與試驗條件相同的試驗培養(yǎng)基中進行藻類預(yù)培養(yǎng)，制備藻類接種物。應(yīng)調(diào)整藻類生物量，使其在接種物培養(yǎng)中的指數(shù)增長占優(yōu)勢，直到試驗開始。藻類接種物培養(yǎng)時，應(yīng)測量接種物培養(yǎng)中藻類生物量的增加，以確保在培養(yǎng)條件下藻類的生長在正常范圍內(nèi)。附錄C中描述了藻類培養(yǎng)程序的一個示例。可以反復(fù)轉(zhuǎn)接2~3次，經(jīng)檢查藻類生長健壯并正處于指數(shù)生長期時即可用來制備試驗中需要的藻液。試驗時，所有試驗液中的藻類的初始生物量應(yīng)相同并足夠低，以保證在營養(yǎng)充足的條件下藻類在成熟期保持指數(shù)增長而沒有養(yǎng)分耗盡的風(fēng)險。初始生物量不應(yīng)超過0.5mg/L干重。各種藻類在試驗液中的初始細胞濃度建議如下：近頭狀尖胞藻（Raphidocelissubcapitata）5×103~5×104個/mL近具棘鏈帶藻（Desmodesmussubspicatus）2×103~5×103個/mL舟形藻（Naviculapelliculosa）104個/mL水華魚腥藻（Anabaenaflos-aquae）104個/mL5GB/T21805—XXXX聚球藻（Synechococcusleopoliensis）5×104~5×105個/mL7.1.2試驗溶液的制備將受試物溶解在經(jīng)滅菌后的新鮮藻類培養(yǎng)基中配制受試物儲備液。試驗時稀釋成不同的濃度，并接種受試藻類接種物，配制成一系列不同濃度的受試物溶液。所有試驗溶液必須包含相同濃度的藻類培養(yǎng)基和藻類初始生物量。如果受試物難溶于水，制備受試物儲備液時可以添加適合的溶劑，例如丙酮、t-丁基乙醇和二甲基甲酰胺等。應(yīng)選用對藻類生長無影響的溶劑，所有試驗溶液（包括對照）中溶劑的添加濃度應(yīng)相同，并且最大允許濃度為100μL/L。7.2試驗操作7.2.1預(yù)試驗為確定正式試驗中受試物濃度的設(shè)置范圍，可以先進行一次預(yù)試驗。預(yù)試驗的濃度可按對數(shù)間距排布，最低濃度應(yīng)為受試物的檢測下限，最高濃度應(yīng)為飽和濃度。測量項目和方法可簡化，試驗時間有時也可縮短。7.2.2正式試驗可以根據(jù)預(yù)試驗的結(jié)果設(shè)置正式試驗的受試物濃度范圍，最好在對藻類產(chǎn)生5%~75%生長抑制效應(yīng)之間以幾何級數(shù)設(shè)置受試物濃度系列。至少設(shè)5個濃度組，公比應(yīng)不超過3.2，對于劑量-效應(yīng)曲線較為平坦的受試物，可能需要更大的公比數(shù)。每個濃度3個平行。如果試驗不需要得出無可觀察效應(yīng)濃度（NOEC），可以適當(dāng)減少平行數(shù)而增加試驗濃度的設(shè)置數(shù)量。應(yīng)同時設(shè)置空白對照組。對照組至少設(shè)3個平行。如果條件允許，對照組平行數(shù)為受試組的2倍。若使用溶劑，還應(yīng)增設(shè)溶劑對照組?？梢耘渲埔惶讍为毜脑囼炄芤河糜谑茉囄餄舛鹊姆治鰷y量。7.2.3試驗培養(yǎng)試驗容器用透氣塞封口，放入培養(yǎng)設(shè)備中。試驗期間，為保持藻細胞的懸浮和CO2的流通，需持續(xù)搖動或攪拌。培養(yǎng)溫度為21℃~24℃,并保持在±2℃的范圍。建議將容器隨機擺放并每天改變其在培養(yǎng)設(shè)備中的位置。試驗期間，對照組pH值的升高應(yīng)小于1.5。如受試物含有金屬或是在試驗的pH值下發(fā)生部分離子化的化合物，需限制pH值的偏離，以確保獲得可重復(fù)的良好的試驗結(jié)果。pH值的偏離小于0.5在理論上是可行的，同時可通過確保有充足的CO2在空氣和試驗液間交換來實現(xiàn)，例如增大搖動頻率。另一個途徑是減少初始生物量或縮短試驗周期來減少對CO2的需求。試驗溶液表面應(yīng)接收持續(xù)均勻的光照，如冷白型或日光型光照。波長在400nm~700nm、光照強度在60μE·m-2·s-1~120μE·m-2·s-1的范圍的光照適用于所推薦綠藻生長（對于單位為Lux的照度計，60μE·m-2·s-1~120μE·m-2·s-1大約為4440Lux~8880Lux的冷白光）。培養(yǎng)區(qū)域的光強差異應(yīng)保持在±15%范圍內(nèi)。7.2.4試驗周期試驗周期為72h。但如果達到質(zhì)量保證與質(zhì)量控制的各項要求，也可根據(jù)實際情況縮短或延長試驗周期。6GB/T21805—XXXX7.2.5測量、分析與觀察試驗期間，至少每天測量各試驗容器中藻類的生物量。如果從試驗溶液中吸取少量試驗液進行測量，測量完成后，嚴(yán)禁將取出的試驗液放回至試驗容器中。試驗開始和結(jié)束時測量試驗液的pH值。試驗開始和試驗期間定期取樣分析，以確定各試驗溶液的初始濃度以及試驗期間的實際暴露濃度。如試驗期間受試物濃度維持在配制濃度（或?qū)崪y初始濃度）±20%的范圍內(nèi)，可僅分析試驗開始和結(jié)束時最高濃度組、最低濃度組和接近50%生長抑制濃度組中受試物的濃度；如無法維持，則應(yīng)測量所有濃度組中受試物的濃度。如果受試物具有揮發(fā)性、不穩(wěn)定性或強吸附性，則應(yīng)每隔24h測量一次，以確定受試物的損失。對于此類物質(zhì)，可能需要增加平行數(shù)。在上述任何情況下，各濃度組只需用1個平行（或?qū)讉€平行中的試驗溶液合并）來測量受試物的濃度。用于受試物濃度分析的培養(yǎng)基應(yīng)與試驗用培養(yǎng)基經(jīng)過同樣的處理，即接種了藻類且在試驗相同的條件下培養(yǎng)。如果需要分析溶解的受試物濃度，需將藻類從培養(yǎng)基中分離。最好使用離心法進行分離，較低轉(zhuǎn)速就可使藻類沉淀。如測量濃度在配制濃度（或?qū)崪y初始濃度）±20%的范圍內(nèi)，可用配制濃度或?qū)崪y初始濃度進行結(jié)果計算；如超出該范圍，則使用實測濃度的幾何平均值或根據(jù)受試物濃度下降的模型進行結(jié)果計算。相較其它絕大多數(shù)短期的水生毒性試驗，藻類生長抑制試驗是一個更加動態(tài)的試驗系統(tǒng)。試驗中實際的暴露濃度難以確定，尤其是對于在低濃度下的強吸附性物質(zhì)。由于吸附于增加的藻類細胞上，試驗溶液中受試物的損失并不意味著它從該試驗系統(tǒng)中消失。計算結(jié)果時，需核查在受試物濃度降低過程中是否伴隨著藻類生長抑制效應(yīng)的減小。如果發(fā)生此類情況，建議使用合適的受試物濃度下降模型；反之則最好采用初始濃度（配制或?qū)崪y）進行計算。試驗結(jié)束時，用顯微鏡觀察試驗接種的藻類細胞外觀是否正常和健康，并記錄藻類細胞的任何異常情況（可能由于暴露于受試物中引起的）。7.2.6藻類生長測量方法測量藻類生長的指標(biāo)和方法很多，建議可以測量以下指標(biāo)：a）細胞計數(shù)在顯微鏡下，用0.1ml計數(shù)框或血球計數(shù)板對藻細胞的數(shù)量計數(shù)。用計數(shù)框時可采用視野法，即對顯微鏡視野中的所有細胞計數(shù)。放大倍數(shù)40×10，每片至少計數(shù)10個視野，如果藻細胞密度小，則要適當(dāng)增加計數(shù)視野，藻數(shù)按視野累加。每次計數(shù)（同一批取樣的樣品）應(yīng)采用相同方法（視野數(shù)目、放大倍數(shù)等）。每一樣品至少計數(shù)兩次，如計數(shù)結(jié)果相差大于15應(yīng)予重復(fù)計數(shù)。如工作量過大，可先取樣，用盧戈氏液固定后保存，留待以后計數(shù)。鏡檢計數(shù)工作量較大，有條件時可采用電子顆粒計數(shù)儀。b）光密度取一定量的測試液在分光光度計上測量其光密度，波長可選用650nm、663nm或其它波長。亦可用熒光光度計測量。c）葉綠素樣品經(jīng)離心或過濾后，用丙酮、乙醇或其它溶劑萃取，進行分光測量。亦可用熒光光度計測量。7.2.7限度試驗如果預(yù)試驗表明受試物濃度達到100mg/L或試驗條件下飽和溶液濃度（該溶解度低于100mg/L）時未對藻類生長產(chǎn)生毒性影響，可進行含有1個對照組和1個濃度組（100mg/L或在試驗條件下飽和溶液濃度）的限度試驗。進行限度試驗，最好有受試物的濃度分析加以佐證。除了平行數(shù)增加到至少6個之外，所有有關(guān)試驗條件、試驗方法、質(zhì)量保證與質(zhì)量控制的描述均適用于限度試驗。對照組和受試組中測得7GB/T21805—XXXX的反應(yīng)變量需用統(tǒng)計學(xué)方法進行比較分析，例如Studentt檢驗。如果兩組的方差不相等，則應(yīng)進行不等方差調(diào)整的t檢驗。8質(zhì)量保證與質(zhì)量控制試驗達到以下標(biāo)準(zhǔn)方為有效：a）試驗開始的72h內(nèi)，對照組藻類呈指數(shù)增長且濃度應(yīng)至少增加16倍，即特定生長率大于等于0.92/d。對于常用的試驗藻種，生長率遠高于此。如試驗使用的藻種生長較慢，該標(biāo)準(zhǔn)可能不適用。如果發(fā)生此類情況，應(yīng)延長試驗周期，直至對照組藻類呈指數(shù)增長且濃度增加16倍。同樣，只要對照組藻類保持無限的指數(shù)增長且濃度增加16倍，也可縮短試驗周期，但至少48h。b）試驗各階段，如0d~1d、1d~2d和2d~3d，對照組各平行的不同階段平均特定生長率變異系數(shù)的平均值應(yīng)不超過35%。c）整個試驗期間，對照組各平行的平均特定生長率變異系數(shù)，用近頭狀尖胞藻（Raphidocelissubcapitata）和近具棘鏈帶藻（Desmodesmussubspicatus）作為藻種時，應(yīng)不超過7%；用其他非常用藻種時，應(yīng)不超過10%。d）試驗期間對照組溶液pH的變化范圍不大于1.5個單位。e）參比物重鉻酸鉀和3,5-二氯苯酚對近頭狀尖胞藻（Raphidocelissubcapitata）的72hErC50參考范圍分別為0.92mg/L~1.46mg/L和2.08mg/L~4.68mg/L。參比物重鉻酸鉀和3,5-二氯苯酚對近具棘鏈帶藻（Desmodesmussubspicatus）的72hErC50參考范圍分別為0.72mg/L~0.96mg/L和4.04mg/L~8.80mg/L。~9數(shù)據(jù)與報告9.1數(shù)據(jù)處理9.1.1繪制生長曲線用測量的替代參數(shù)（如藻細胞濃度、熒光性）表示試驗容器中藻類的生物量。以表格形式列出24h、48h和72h對照組和各受試組的試驗容器中的藻類生物量。以時間為橫軸，藻類生物量為縱軸，取各平行的平均值，繪制對照組和各受試組的藻類生長曲線。須使用對數(shù)坐標(biāo)軸，也可使用直線坐標(biāo)軸。用對數(shù)坐標(biāo)軸作出的生長曲線是一條直線，其斜率就是藻類的特定生長率。觀察生長曲線，檢查整個試驗期間對照組的生長是否達到預(yù)期的指數(shù)增長。仔細檢查所有數(shù)據(jù)點和圖表，核對原始數(shù)據(jù)和程序是否存在可能的錯誤。仔細檢查可能偏離系統(tǒng)誤差的所有數(shù)據(jù)點。如果發(fā)現(xiàn)了明顯的程序上的錯誤或該錯誤發(fā)生的可能性非常高，將相關(guān)的數(shù)據(jù)點標(biāo)為異常值，并在進行下一步的統(tǒng)計分析時剔除這些數(shù)據(jù)。（如果其中一個平行中藻類的濃度為零，那可能是該平行試驗液中未接入藻類或器皿的洗滌方法不正確）。試驗報告中對于作為異常值被剔除的數(shù)據(jù)應(yīng)闡明其原因?？梢越邮艿脑騼H限于（罕見的）程序錯誤，而不僅僅是精度差。異常值識別的統(tǒng)計程序?qū)@類問題的用途有限，不能代替專家判斷。最好在之后出現(xiàn)的圖表中保留異常值。9.1.2選擇反應(yīng)變量試驗的目的是確定受試物質(zhì)對藻類生長的影響。有兩個反應(yīng)變量，分別是平均特定生長率和生長量。使用這兩個反應(yīng)變量計算的毒性值不具有可比性，應(yīng)用試驗結(jié)果時必須認識到這種差異。試驗條件，基于平均特定生長率(ErCx)的ECx值通常會高于基于生長量(EyCx)的結(jié)果，這是由于各自方法的數(shù)學(xué)基礎(chǔ)。8GB/T21805—XXXX這僅僅只是數(shù)值在數(shù)學(xué)上不同，不應(yīng)被解釋為兩個反應(yīng)變量存在靈敏度差異。平均特定生長率是基于藻類在非限制培養(yǎng)中的一般指數(shù)生長模式，其中毒性是根據(jù)對生長速率的影響來估計的，而不依賴于對照組特定生長率的絕對水平、濃度-反應(yīng)曲線的斜率或試驗持續(xù)時間。相反，基于生長量的毒性結(jié)果受所有這些其他因素的影響，EyCx取決于每個試驗使用的藻類物種的特定生長率和最大特定生長率，而這些在不同藻類之間甚至相同藻類不同菌株之間都可能是不同的。生長量不應(yīng)用于比較藻類甚至不同菌株對受試物的敏感性。因此科學(xué)上更傾向于使用平均特定生長率來估算毒性。9.1.3濃度的換算把顯微鏡視野計數(shù)結(jié)果換算為細胞濃度N，見式（1）：式中：Cs為計數(shù)框面積（20mm×20mm）Fs=πr2；Fs為視野面積；r＝測量值（mm），r為視野半徑；Pn＝n1+n2+???+ni（i＝n）；其中N（個/ml）每瓶試樣中藻濃度；Pn為n個視野細胞數(shù)累加值；ni為第i個視野的藻細胞數(shù)。9.1.4計算參數(shù)a）特定生長率和基于生長率的抑制率特定生長率，見式（2）。式中：μi-j——從i時間到j(luò)時間的特定生長率，單位為每天（d-1Xi——i時間的生物量；Xj——j時間的生物量。對于對照組和各受試組，計算各平行的特定生長率的平均值和方差估算值。采用藻類初始接種生物量的設(shè)定值計算整個試驗周期（通常0d~3d）的平均特定生長率，比采用測量值計算的更精確。如果生物量測量儀器允許足夠精確地測量低接種物生物量（如流動血細胞計數(shù)儀可使用初始生物量的測量值進行計算。計算并評估試驗過程中每天的（0d~1d、1d~2d和2d~3d）特定生長率，并檢查對照組的生長率是否符合質(zhì)量保證與質(zhì)量控制的要求。如果與總平均特定生長率相比，第一天的特定生長率相當(dāng)?shù)?，說明第一天藻類處于生長停滯期。通過預(yù)培養(yǎng)消除對照組中的生長停滯期或使其最小化，暴露組中的生長停滯表明藻類經(jīng)受試物作用后可能恢復(fù)或由于受試物的損失（包括吸附于藻類）減少了暴露量。因此，為了評價暴露期間發(fā)生的受試物對藻類生長的影響，應(yīng)評價試驗各階段的生長率。如果平均特定生長率和各階段生長率間存在顯著差異，說明藻類未保持持續(xù)指數(shù)增長，因此，要仔細檢查生長曲線?；谏L率的抑制率，見式（3）。9GB/T21805—XXXX式中：Ir——基于特定生長率的抑制率，%；μC——對照組各平行特定生長率的平均值；μT——受試組各平行的特定生長率的平均值。b）生長量和基于生長量的抑制率生長量，計算方法是將每個對照和處理試驗容器中暴露結(jié)束時的生物量減去起始時的生物量，獲得各平行的生長量。對于對照組和各受試組，計算各平行的生長量的平均值和方差估算值?；谏L量的抑制率，見式（4）。式中：Iy——基于生長量的抑制率，%；YC——對照組各平行生長量的平均值；YT——受試組各平行的生長量的平均值。c）計算基于生長率的抑制率或基于生長量的抑制率時，如果試驗添加了溶劑，應(yīng)選擇溶劑對照組進行計算。9.1.5繪制濃度-效應(yīng)曲線以受試物濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，特定生長率或生長量的抑制率為縱坐標(biāo)，作回歸曲線，即為濃度-效應(yīng)曲線。繪制曲線時忽略上一階段定為異常值的數(shù)據(jù)。通過觀察或計算機內(nèi)插法畫一條通過各數(shù)據(jù)點的平滑線，從而獲得初步的濃度-效應(yīng)關(guān)系，然后使用更詳細的方法，最好是計算機統(tǒng)計方法做進一步分析。有時，根據(jù)數(shù)據(jù)的質(zhì)量（精度）和數(shù)量以及數(shù)據(jù)分析工具的可用性，可能會決定（有時是有充分理由的）在此階段停止進一步的數(shù)據(jù)分析，并根據(jù)初步的擬合曲線獲取關(guān)鍵數(shù)據(jù)EC50和EC10（和/或EC20這取決于數(shù)據(jù)的預(yù)期用途。不使用統(tǒng)計方法的正當(dāng)理由可能包括：a）計算機處理方法不適用于這些數(shù)據(jù)，并不能產(chǎn)生比專家判斷更可靠的結(jié)果——在這種情況下，一些計算機程序甚至可能無法產(chǎn)生可靠的解決方案（迭代可能不收斂等）b）一般的計算機程序不適于處理生長刺激效應(yīng)。9.1.6統(tǒng)計過程通過回歸分析獲得定量的濃度-效應(yīng)關(guān)系。對反應(yīng)數(shù)據(jù)進行線性變換（如probit變換或logit變換或Weibull變換）后，可以進行加權(quán)線性回歸。非線性回歸能更好地處理不可避免的數(shù)據(jù)不規(guī)范和偏離光滑分布的問題，因此是更合適的方法。但當(dāng)反應(yīng)近于零抑制或完全抑制時，數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換可能會放大不規(guī)范性以致影響分析。應(yīng)注意，在標(biāo)準(zhǔn)的分析方法中，probit、logit或Weibull變換一般用于二元數(shù)據(jù)（如死亡率或生存率），如果用于生長或生物量數(shù)據(jù)，則必須進行修改。附錄D中進一步詳細說明了非線性回歸分析的應(yīng)用。對于要分析的每個反應(yīng)變量，應(yīng)根據(jù)濃度-效應(yīng)關(guān)系對ECx值進行點估計，可能的話，還應(yīng)確定每個點估計的95%的置信限。應(yīng)以圖或統(tǒng)計的方式評估反應(yīng)數(shù)據(jù)對回歸模型的擬合優(yōu)度。進行回歸分析時，GB/T21805—XXXX應(yīng)使用個體重復(fù)反應(yīng)值而非處理組均值。但是，如果由于數(shù)據(jù)過于分散而很難或無法進行非線性曲線擬合，則通過對組均值進行回歸可避免這一問題，是減少可疑異常值影響的一個實用方法。如果采用這樣的處理程序，則應(yīng)在檢驗報告中說明，是因為使用個體重復(fù)數(shù)據(jù)進行曲線擬合的結(jié)果不好，因此未采用常規(guī)程序。如果可用的回歸模型/方法不適用于數(shù)據(jù)，也可以使用自舉線性插值法獲得EC50的估計值和置信限。為檢驗受試物對生長率的影響，應(yīng)使用方差分析(ANOVA)技術(shù)比較處理組均值，以估計LOEC進而估計NOEC。然后，應(yīng)使用適當(dāng)?shù)亩嘀乇容^或趨勢檢驗方法將每個濃度組的均值與對照組均值進行比較，Dunnett檢驗或Williams檢驗可能是較好的方法。必須用圖或正式檢驗的方法檢驗ANOVA的方差齊性假設(shè)是否成立，這里，Levene檢驗或Bartlett檢驗都適用。如果方差齊性假設(shè)不成立，可以通過對數(shù)據(jù)進行對數(shù)變換來校正。如果方差表現(xiàn)為極端異質(zhì)性，且難以通過數(shù)據(jù)變換來較正，則應(yīng)該考慮采用step-downJonkheere趨勢檢驗等其他分析方法。近期的科學(xué)發(fā)展建議放棄NOEC的概念，以ECx替代。但對藻類試驗，x的合適取值尚未確定。（根據(jù)所選擇的反應(yīng)變量，）x在10%-20%范圍內(nèi)取值似乎都可以，因此EC10和EC20最好都報告。9.1.7生長刺激有時會觀察到低濃度的生長刺激效應(yīng)（負抑制）。這可能是由于受試物的興奮效應(yīng)（“毒性刺激”）或?qū)⒋碳ば陨L因子與受試物一起添加到所用的藻類培養(yǎng)基中造成的。請注意，添加無機營養(yǎng)元素不應(yīng)有任何直接影響，因為培養(yǎng)基應(yīng)在整個試驗過程中保持營養(yǎng)過剩。低劑量刺激通常在EC50計算中可以忽略，除非它是極端的。但是，如果它是極端的，或者要計算低x的ECx值，則可能需要特殊計算機程序。如果可能，應(yīng)避免從數(shù)據(jù)分析中刪除刺激反應(yīng)，如果可用的曲線擬合軟件不能接受輕微刺激，則可以使用帶自舉的直線內(nèi)插法。如果刺激是極端的，可以考慮使用興奮效應(yīng)模型（hormesismodel）。9.1.8非毒性生長抑制光吸收試驗材料可能會導(dǎo)致藻類生長速率降低，因為吸光會減少可用光量。應(yīng)通過修改試驗條件將此類物理效應(yīng)與毒性效應(yīng)區(qū)分開來，并在試驗報告中做出單獨說明。9.2試驗報告試驗報告應(yīng)包括以下內(nèi)容：a）受試物.物理屬性和相關(guān)理化性質(zhì)，包括水中溶解度；.化學(xué)特性（如CAS編號），包括純度。b）受試生物.藻類的種類、來源或提供者，以及培養(yǎng)條件。c）試驗條件.試驗開始日期和持續(xù)時間；.試驗設(shè)計：試驗容器、培養(yǎng)體積和試驗開始時的生物量密度；.培養(yǎng)基的成分；.試驗濃度和平行（如平行數(shù)、試驗濃度數(shù)及其公比）；.試驗溶液的配制，包括溶劑的使用；.培養(yǎng)設(shè)備；.光照強度和光質(zhì)（來源，是否均勻.溫度；.濃度測量：設(shè)定濃度和所有實測濃度。應(yīng)說明添加回收試驗的方法和儀器的最低檢測限；GB/T21805—XXXX.對本文件的所有偏離；.生物量的測量方法，以及所測參數(shù)和干重的關(guān)系。d）結(jié)果.試驗開始和結(jié)束時各受試組的pH值；.生物量的測量方法，以及各測量時間各試驗容器中的生物量；.生長曲線（生物量-時間）；.計算出的各平行的各參數(shù)值，及其平均值和變異系數(shù)；.劑量-效應(yīng)曲線；.評估受試物對藻類的毒性，如EC50、EC10、EC20及其置信區(qū)間。LOEC和NOEC及其統(tǒng)計方法（可選）；.如果采用單因素方差分析（ANOVA）進行統(tǒng)計，說明最小顯著差數(shù)；.各受試組中任何對藻類生長有刺激效應(yīng)的結(jié)果；.觀察到的其他效應(yīng)，如藻類在形態(tài)學(xué)上的改變；.結(jié)果討論，包括對偏離的解釋說明。GB/T21805—XXXX（資料性）試驗藻種A.1生物品系A(chǔ).1.1綠藻近頭狀尖胞藻（Raphidocelissubcapitata，曾用名：羊角月芽藻/Pseudokirchneriellasubcapitata）近具棘鏈帶藻（Desmodesmussubspicatus，曾用名：柵藻/Scenedesmussubspicatus）普通小球藻（Chlorellavulgaris）A.1.2硅藻舟形藻（Naviculapelliculosa）A.1.3藍藻水華魚腥藻（Anabaenaflos-aquae）聚球藻（Synechococcusleopoliensis）A.2外觀和特征表A.1試驗藻種的外觀和特征subcapitata）subspicatus）pelliculosa）flos-aquae）leopoliensis）40~50ab用細胞大小計算的結(jié)果；A.3試驗藻種的培養(yǎng)與測量A.3.1近頭狀尖胞藻（Raphidocelissubcapitata）和近具棘鏈帶藻（Desmodesmussubspicatus）GB/T21805—XXXX多種培養(yǎng)基適用于這兩種綠藻。合適的培養(yǎng)基類型可由提供單位獲取。單個細胞，細胞密度的測量比較簡單，可用電子顆粒計數(shù)儀或顯微鏡。A.3.2水華魚腥藻（Anabaenaflos-aquae）多種培養(yǎng)基適用于此藻。注意，必須在藻類進入生長停滯期前轉(zhuǎn)接，否則將難以恢復(fù)。水華魚腥藻（Anabaenaflos-aquae）會生長成鏈狀細胞的集合體。根據(jù)培養(yǎng)條件的不同，形成的集合體大小形狀也不同。進行顯微鏡下細胞計數(shù)或電子顆粒計數(shù)儀計數(shù)時必須破壞該集合體。為了減小計數(shù)差異，取樣并進行超聲波處理以破壞細胞的鏈狀結(jié)構(gòu)。經(jīng)超聲波處理后，鏈狀細胞鏈長變短，但是超聲時間過長會破壞細胞。各受試組超聲的強度和時間應(yīng)相同。計數(shù)足夠的視野數(shù)（血球計數(shù)板，至少400個小格）有利于補償計數(shù)差異。這可以改善顯微鏡下測量密度的可靠性?？梢允褂秒娮宇w粒計數(shù)儀測量經(jīng)超聲斷鏈處理的總細胞體積。將藻種接種至試驗容器中時，采用攪拌或其他類似方法使接種物懸浮。持續(xù)振蕩（150轉(zhuǎn)/min）或定時劇烈搖動試驗容器，以防魚腥藻聚團。如果已形成團狀物，在取樣進行測量時應(yīng)劇烈搖動，以破壞藻團并使藻細胞均勻分布。A.3.3聚球藻（Synechococcusleopoliensis）多種培養(yǎng)基適用于此藻。合適的培養(yǎng)基類型可由提供單位獲取。單個桿狀細胞。細胞非常小，用顯微鏡計數(shù)很復(fù)雜也很困難。使用電子顆粒計數(shù)儀時，粒徑范圍應(yīng)調(diào)至1μm。也可使用體外熒光計進行測量。A.3.4舟形藻（Naviculapelliculosa）多種培養(yǎng)基適用于此藻。合適的培養(yǎng)基類型可由提供單位獲取。注意培養(yǎng)基中硅酸鹽的量。在某些生長條件下會形成團狀物。該藻類細胞有時能夠產(chǎn)生脂類，因此在液面可能積聚成膜。基于以上原因，為了獲得具有代表性的樣品，在取樣測量時需采用某些特殊的方法。例如使用漩渦攪拌器劇烈攪動。GB/T21805—XXXX（資料性）培養(yǎng)基B.1OECD藻類培養(yǎng)基OECD藻類培養(yǎng)基同ISO8692中所述培養(yǎng)基，配制方法見表B.1。表B.1OECD藻類培養(yǎng)基NH4ClMgCl2?6H2OCaCl2?2H2OMgSO4?7H2OKH2PO4FeCl3?6H2OH3BO3MnCl2?4H2ONa2MoO4?2H2ONaHCO3Na2SiO3?9H2O將配制好的儲備液經(jīng)0.2μm濾膜過濾或高壓滅菌（120℃,15min），4℃避光冷藏保存。儲備液2和儲備液4只能通過濾膜過濾滅菌。GB/T21805—XXXXB.2APP藻類培養(yǎng)基APP藻類培養(yǎng)基同ASTM中所述培養(yǎng)基，配制方法見表B.2。表B.2APP藻類培養(yǎng)基NaNO3MgCl2?6H2OH3BO3MnCl2?4H2OFeCl3?6H2ONa2MoO4?2H2ONa2SeO4?5H2O bMgSO4?7H2OK2HPO4NaHCO3--Na2SiO3?9H2Oab只有硅藻的儲備培養(yǎng)時需要。定容用水為去離子水或蒸餾水。使用0.1mol/L或1.0mol/L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值至7.5±0.1。將配制好的培養(yǎng)基經(jīng)0.22μm濾膜（使用電子顆粒計數(shù)儀進行細胞計數(shù)時）或0.45μm濾膜（不使用電子顆粒計數(shù)儀進行細胞計數(shù)時）過濾滅菌，4℃避光冷藏保存直至用于實驗。GB/T21805—XXXXB.3OECD藻類培養(yǎng)基和AAP藻類培養(yǎng)基中各成分的比較表B.3OECD藻類培養(yǎng)基和AAP藻類培養(yǎng)基中各成分的比較NaHCO3NaNO3NH4ClMgCl2?6H2OCaCl2?2H2OMgSO4?7H2OK2HPO4KH2PO4FeCl3?6H2OH3BO3MnCl2?4H2ONa2MoO4?2H2OpHEDTA的摩爾比率略高于單位元素的。這樣可以避免離子沉淀，同時使重金屬離子的螯合作用最小化。在使用舟形藻（Naviculapelliculosa）作為受試生物時，兩種培養(yǎng)基中都需補充Na2SiO3?9H2O，使其濃度達到1.4mg/L（以Si計）。培養(yǎng)基的pH值是液體中的碳酸鹽和空氣中CO2的部分壓力之間平衡的結(jié)果。25℃時的pH值與重碳酸鹽的摩爾濃度之間的近似關(guān)系見式（B.1）。式中：NaHCO3為15mg/L時，pHeq=7.5（AAP培養(yǎng)基）NaHCO3為50mg/L時，pHeq=8.1（OECD培養(yǎng)基）GB/T21805—XXXXB.4OECD和AAP培養(yǎng)基中各元素的比較表B.4OECD和AAP培養(yǎng)基中各元素的比較CNPKNaGB/T21805—XXXX藻類培養(yǎng)過程示例C.1一般建議根據(jù)以下程序培養(yǎng)藻類的目的是為了培養(yǎng)毒性試驗所用的藻類。所使用的方法應(yīng)確保藻類不受細菌污染。無菌培養(yǎng)可能是可取的，但必須建立和使用單藻培養(yǎng)。所有操作必須在無菌條件下進行，以免受到細菌和其他藻類污染。C.2設(shè)備和材料C.3培養(yǎng)程序C.3.1準(zhǔn)備培養(yǎng)基中所有營養(yǎng)鹽都以濃縮儲備液形式避光冷藏保存。這些溶液通過過濾或高壓滅菌消毒。配制培養(yǎng)基時，將相應(yīng)量的儲備液加到無菌的蒸餾水中。注意不要發(fā)生污染。對于固體培養(yǎng)基加0.8％的瓊脂即可。C.3.2儲備培養(yǎng)儲備培養(yǎng)是定期將藻類轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基中作為初始測試材料的小型藻類培養(yǎng)。如果藻類不經(jīng)常使用，可以在試管內(nèi)固體培養(yǎng)基斜面上保存，至少兩個月轉(zhuǎn)接一次。用三角瓶進行儲備培養(yǎng)時要控制培養(yǎng)基的量（如體積為100ml），若在溫度為20℃、連續(xù)光照的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，要一個星期轉(zhuǎn)接一次。在大量轉(zhuǎn)接時要用無菌吸管轉(zhuǎn)接到有新鮮培養(yǎng)基三角瓶內(nèi)。這樣，對于生長快速的品種，其初始濃度比原培養(yǎng)物低100倍。可以從生長曲線確定藻類的生長速率。若生長率已知，就可以估計轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基的密度。培養(yǎng)物必須在到達衰亡期之前轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基中。C.3.3預(yù)培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)旨在為試驗提供一定量的適合接種測試的藻類培養(yǎng)物。預(yù)培養(yǎng)應(yīng)在與試驗要求相同的條件下進行。通常培養(yǎng)2d~4d后藻類仍處于指數(shù)生長階段即可用于試驗接種。若鏡檢發(fā)現(xiàn)藻類預(yù)培養(yǎng)物被污染或生長異常（如畸形等）應(yīng)廢棄。GB/T21805—XXXX非線性回歸數(shù)據(jù)分析D.1總體思路藻類試驗和其他微生物生長試驗中的反應(yīng)——生物量的生長——本質(zhì)上是一個連續(xù)的測量變量。如果使用生長速率，為過程速率；如果使用生物量，則為其隨時間的積分。兩者都對應(yīng)于非暴露控制下重復(fù)試驗的反應(yīng)均值，反映了所施加條件（光照和溫度是藻類試驗的主要影響因素）下的最大反應(yīng)值。試驗系統(tǒng)是連續(xù)分布的或同質(zhì)的，可以將生物量視為一個不存在斷開的連續(xù)統(tǒng)。此類系統(tǒng)中，反應(yīng)的方差分布只與試驗因素有關(guān)（通常用誤差的對數(shù)正態(tài)分布或正態(tài)分布描述）。與通常以分?jǐn)?shù)表示的生物測量反應(yīng)變量相反，生物個體的耐受度（通常為二項分布）一般假定為最主要的方差影響因素?？刂品磻?yīng)在這里為零或本底水平。在不復(fù)雜的情況下，歸一化的或相對的反應(yīng)值，r，將從1（零抑制）單調(diào)下降到0（完全抑制）。應(yīng)注意，所有反應(yīng)值都有一個誤差相伴，明顯的負抑制僅是計算的隨機誤差結(jié)果。D.2回歸分析D.2.1模型回歸分析的目的是以數(shù)學(xué)回歸函數(shù)Y=f(C)的形式或更常用的F(Z)的形式（其中Z＝logC）來定量描述濃度反應(yīng)曲線。用其逆函數(shù)C=f-1(Y)計算ECX值，包括EC50、EC10和EC20及其95%的置信限。已經(jīng)有幾個簡單的數(shù)學(xué)函數(shù)形式被證明可以在藻類生長抑制試驗中成功地描述濃度-效應(yīng)關(guān)系，例如logistic方程、非對稱Weibul方程和對數(shù)正態(tài)分布函數(shù)，這些函數(shù)都是S形曲線，當(dāng)C趨近于0時漸進于0，當(dāng)C趨近于無窮時漸進于1。最近提出的使用連續(xù)閾值的函數(shù)模型（例如Kooijman的“種群生長抑制”模型，Kooijman等，1996）或可作為漸進模型的替代方法。該模型假設(shè)，濃度低于某閾值EC0+時沒有影響，其反應(yīng)值用在起點不可微的簡單連續(xù)函數(shù)濃度軸上截距所對應(yīng)的反應(yīng)值來進行估計。應(yīng)注意，如果方差異質(zhì)性得到補償，則可用殘差平方和（固定方差假設(shè)）或加權(quán)平方和的簡單最小化來進行分析。D.2.2過程統(tǒng)計過程可概括如下：選擇適當(dāng)?shù)暮瘮?shù)方程，Y=f(C)，用非線性回歸擬合數(shù)據(jù)。為了從數(shù)據(jù)中獲得盡可能多的信息，使用每個燒瓶的測量值要優(yōu)于使用重復(fù)測量的均值。但另一方面，實踐經(jīng)驗表明，如果測量方差較大，則與使用單個的數(shù)據(jù)點相比，使用重復(fù)測量的均值可以提供更穩(wěn)健的數(shù)學(xué)估計，系統(tǒng)誤差的影響更小。繪制擬合曲線，檢驗其是否較好擬合了測量數(shù)據(jù)，殘差分析是擬合效果檢查中特別有用的工具。如果所選的濃度反應(yīng)擬合函數(shù)不能很好地描述整個曲線或者曲線中的某些重要部分，例如低濃度時的反應(yīng)，可選擇另外