高三 人教版選擇性必修三 生物 第3章《重組DNA技術(shù)的基本工具》課件

高三—人教版選擇性必修三—生物—第3章重組DNA技術(shù)的基本工具知識回顧

基因工程是指按照人們的愿望,通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性,創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫作DNA重組技術(shù)。理論基礎(chǔ)（1）DNA的基本組成單位和空間結(jié)構(gòu)相同；（2）堿基對的配對方式相同；

（3）基因控制蛋白質(zhì)的合成且共用一套遺傳密碼。

番木瓜是“嶺南四大佳果”之一。但是，一直以來番木瓜的生長都受到環(huán)斑病毒（PRSV,一種單鏈RNA病毒）的威脅，嚴(yán)重的時(shí)候會(huì)導(dǎo)致番木瓜減產(chǎn)80%-90%。

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將PRSV的復(fù)制酶基因轉(zhuǎn)入番木瓜植株，獲得了優(yōu)質(zhì)的抗病毒番木瓜——“華農(nóng)1號”，該品種可抵抗華南地區(qū)現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的5個(gè)病毒株系。該品種于2006年獲農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)準(zhǔn)予在廣東省生產(chǎn)應(yīng)用的安全證書，目前已在華南地區(qū)廣泛種植，這也是我國首例轉(zhuǎn)基因果樹植物批準(zhǔn)商品化生產(chǎn)，帶來了良好的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和環(huán)境收益。實(shí)例：番木瓜“華農(nóng)一號”的培育

番木瓜“華農(nóng)一號”培育的大致流程如圖所示，請你根據(jù)所學(xué)知識：①簡要描述“華農(nóng)一號”培育的主要步驟；②說出每個(gè)步驟中需要何種工具？步驟一：步驟二：目的基因與運(yùn)載體分子拼接步驟三：重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞獲取目的基因：切割、改造“分子手術(shù)刀”“分子縫合針”“分子運(yùn)輸車”一、“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶1.來源：主要從原核生物中分離純化而來2.作用特點(diǎn)：

能夠?qū)Ｒ恍宰R別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，

并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開.1.你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA，達(dá)到保護(hù)自身的目的。2.為什么限制性內(nèi)切酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？①其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識別切割序列。②通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。思考:EcoRⅠ(識別GAATTC序列,在G與A之間切割)SmaⅠ(識別GGGCCC序列,在G與C之間切割)5'5'3'3'5'5'3'3'黏性末端平末端3．作用結(jié)果中心軸線兩側(cè)中心軸線處對點(diǎn)練習(xí)：1.請寫出下列限制酶切割形成的黏性末端不同的限制酶也可能會(huì)形成相同的黏性末端同尾酶：使切割點(diǎn)的選擇范圍擴(kuò)大對點(diǎn)練習(xí)：2.請判斷：以下黏性末端是由______種限制酶作用產(chǎn)生。3注意觀察識別序列和切割位點(diǎn)①配對黏性末端②找到切割位點(diǎn)③補(bǔ)全序列一做題技巧：TTAAGC為讓抗PRSV基因與質(zhì)粒拼接，需要在抗PRSV基因兩端分別添加對應(yīng)的限制酶的酶切位點(diǎn)。番木瓜“華農(nóng)一號”的培育大致流程如圖所示：二、“分子縫合針”——DNA連接酶1.作用：2.種類：⑴E.coliDNA連接酶⑵T4DNA連接酶將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。E·coliDNA連接酶與T4DNA連接酶比較：類型

來源E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶功能大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點(diǎn)差別思考：DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？DNA連接酶DNA連接酶ATAGTCCGAATTDNA連接酶：連接兩個(gè)DNA片段CAATTGAGTATCDNA聚合酶DNA聚合酶：連接單個(gè)脫氧核苷酸形成單鏈小結(jié)DNA連接酶與DNA聚合酶的比較DNA連接酶DNA聚合酶相同點(diǎn)作用實(shí)質(zhì)化學(xué)本質(zhì)不同點(diǎn)模板作用對象作用結(jié)果用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì)

不需要需要DNA的一條鏈作模板形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程、DNA復(fù)制DNA復(fù)制只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵二三、“分子運(yùn)輸車”—基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體質(zhì)粒作為運(yùn)載工具，將外源基因送入受體細(xì)胞。2.作用：動(dòng)植物病毒噬菌體1.種類：質(zhì)粒③有特殊的標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選①有一或多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)②能在受體細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制并穩(wěn)定保存④對受體細(xì)胞無害，易分離

質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨(dú)立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外的環(huán)狀雙鏈DNA分子。對點(diǎn)練習(xí)：下圖是某一質(zhì)粒和目的基因上的限制酶切位點(diǎn)示意圖，應(yīng)該選用哪種限制酶切割來構(gòu)建重組質(zhì)粒？圖1圖2BamHI

和

HindIII①

防止目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化不能用E.coRI的原因：②

防止目的基因反向連接到質(zhì)粒上不能用SmaI的原因：SmaI會(huì)破壞目的基因?yàn)樽尶筆RSV基因與質(zhì)粒拼接并表達(dá)，需在抗PRSV基因的上下游分別添加限制

和

的酶切位點(diǎn)。番木瓜“華農(nóng)一號”的培育大致流程如圖所示：HindIIIBamHI思維提升1、選目的基因兩端和運(yùn)載體都有的酶切位點(diǎn)；2、酶切位點(diǎn)不能破壞目的基因以及質(zhì)粒中的重要元件；3、至少保留一個(gè)完整的標(biāo)記基因，便于篩選；4、盡量使用雙酶切法，可以防止目的基因、載體的自身環(huán)化以及目的基因與載體反向連接；選擇限制酶的原則：限制酶作用部位：種類E.coliDNA連接酶運(yùn)載體條件③

有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)質(zhì)粒、噬菌體、動(dòng)植物病毒DNA連接酶作用部位：切開DNA分子的磷酸二酯鍵來源：主要存在于原核生物中特點(diǎn)：具有專一性（能識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列）T4DNA連接酶①

對受體細(xì)胞無害②

能自我復(fù)制或整合到宿主DNA上。④

常有特殊的標(biāo)記基因種類：磷酸二酯鍵作用結(jié)果：產(chǎn)生黏性末端或平末端本節(jié)小結(jié)實(shí)驗(yàn)與探究:DNA的粗提取與鑒定1.實(shí)驗(yàn)原理：提?。篋NA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精，利用這一原理，可以使DNA析出，初步分離DNA與蛋白質(zhì)。DNA在不同濃度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。在一定溫度下，DNA遇二苯胺

會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色。鑒定：2.實(shí)驗(yàn)材料：新鮮洋蔥（香菜、菠菜、菜花或豬肝等）也可以用雞血細(xì)胞，需加入檸檬酸鈉，防止血液凝固3.試劑：①研磨液②體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺試劑含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl研磨液成分作用Tris-HCl緩沖液穩(wěn)定DNAEDTA抑制DNA酶SDS使蛋白質(zhì)變性溶解細(xì)胞膜使蛋白質(zhì)變性與DNA分離4.實(shí)驗(yàn)步驟取材、研磨過濾或離心取溶液預(yù)冷酒精析出DNA或離心收集沉淀中的DNANaCl溶液溶解DNA并鑒定五、注意事項(xiàng)1．加入酒精和用玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要輕緩，且沿一個(gè)方向攪拌，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀2．酒精要預(yù)冷：①可抑制DNA水解酶的活性，進(jìn)而抑制DNA降解②抑制分子運(yùn)動(dòng)，使DNA易形成沉淀析出③低溫有利于增加DNA分子的柔韌性，減少其斷裂六、結(jié)果分析與評價(jià)1．某同學(xué)提取出的絲狀物發(fā)黃，用二苯胺試劑鑒定，藍(lán)色不明顯，是什么原因？如果提取的DNA不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質(zhì)較多;如果鑒定不呈現(xiàn)藍(lán)色，也說明提取的DNA含量低，或者在實(shí)驗(yàn)操作過程中出現(xiàn)了失誤等。2．你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些雜質(zhì)嗎？本實(shí)驗(yàn)粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)。謝謝觀看！高三—人教版選擇性必修三—生物—第3章重組DNA技術(shù)的基本工具答疑一、選擇題：1．（2023·山西·高考真題）某同學(xué)擬用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA連接酶為工具，將目的基因（兩端含相應(yīng)限制酶的識別序列和切割位點(diǎn)）和質(zhì)粒進(jìn)行切割、連接，以構(gòu)建重組表達(dá)載體。限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。

下列重組表達(dá)載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是（

）A．質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA連接酶連接B．質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接C．質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接D．質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接C【解析】考點(diǎn)：限制酶和DNA連接酶的作用特點(diǎn)。只有T4DNA連接酶可以連接平末端。2．（2023·湖北·高考真題）用氨芐青霉素抗性基因（AmpR）、四環(huán)素抗性基因（TetR）作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達(dá)載體（重組質(zhì)粒），并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯(cuò)誤的是（）

A．若用HindⅢ酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四環(huán)素）培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因C．若用SphⅠ酶切，可通過DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否D．若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp（氨芐青霉素）和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落D2．（2023·湖北·高考真題）用氨芐青霉素抗性基因（AmpR）、四環(huán)素抗性基因（TetR）作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達(dá)載體（重組質(zhì)粒），并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯(cuò)誤的是（）

A．若用HindⅢ酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四環(huán)素）培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因D【解析】A、若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，因而轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同，A正確。B、若用PvuⅠ酶切，氨芐青霉素抗性基因被破壞，四環(huán)素抗性基因完整，但重組質(zhì)粒和質(zhì)粒中都有四環(huán)素抗性基因，因此在含四環(huán)素培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因，B正確；2．（2023·湖北·高考真題）用氨芐青霉素抗性基因（AmpR）、四環(huán)素抗性基因（TetR）作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達(dá)載體（重組質(zhì)粒），并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯(cuò)誤的是（）

C．若用SphⅠ酶切，可通過DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否【解析】C、DNA凝膠電泳技術(shù)可以分離不同大小的DNA片段，重組質(zhì)粒的大小與質(zhì)粒不同，能夠鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否，C正確；D2．（2023·湖北·高考真題）用氨芐青霉素抗性基因（AmpR）、四環(huán)素抗性基因（TetR）作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達(dá)載體（重組質(zhì)粒），并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯(cuò)誤的是（）

D．若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp（氨芐青霉素）和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落【解析】D、SphⅠ的酶切位點(diǎn)位于四環(huán)素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，四環(huán)素抗性基因被破壞，但重組質(zhì)粒中含氨芐青霉素抗性基因（AmpR），因此攜帶目的基因的受體菌在含Amp（氨芐青霉素）的培養(yǎng)基中能形成菌落，在含Tet的培養(yǎng)基中不能形成菌落，D錯(cuò)誤。