洗滌劑中乙二胺四乙酸（EDTA）、氮川三乙酸（NTA）及二乙烯三胺五乙酸（DTPA）的測定 高效液相色譜法編制說明（征求意見稿）

第第I頁共14頁《洗滌劑中乙二胺四乙酸（EDTA）、氮川三乙酸（NTA）及二乙烯三胺五乙酸（DTPA）的測定高效液相色譜法》編制說明（征求意見稿）一、工作簡況1.1任務來源本標準根據(jù)《國家標準化管理委員會關于下達2023年第三批推薦性國家標準計劃及相關標準外文版計劃的通知》（國標委發(fā)[2023]58號）制訂，項目名稱為“洗滌劑中乙二胺四乙酸（EDTA）、氮川三乙酸（NTA）及二乙烯三胺五乙酸（DTPA）的測定高效液相色譜法”，項目編號為20231473-T-607，主要起草單位為XXX等，計劃應完成時間為2025年5月。1.2主要工作過程（1）起草階段2023年12月，廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院按照全國表面活性劑和洗滌用品標準化技術委員會（SAC/TC272）的要求成立了標準起草工作組，并制訂了標準研制計劃。2023年12月-2024年1月，標準起草工作組進行了大量的研究分析、資料查證及方法確認等工作，初步設計了實驗方案。2024年2月-2024年5月，根據(jù)實驗方案，優(yōu)化確定衍生條件和色譜分離條件，優(yōu)化確定液體類、粉類洗滌劑的提取、測定條件，考察方法的靈敏度、準確性、線性范圍和適用性，并組織單位進行方法驗證；編寫標準征求意見稿和編制說明。（2）征求意見階段2024年6月-2024年8月，通過廣州質(zhì)檢院官方網(wǎng)站向社會公開征求意見、向本領域其他單位定向征求意見，以及全國檢標委秘書處在國家標準制修訂工作管理信息系統(tǒng)公開征求意見（60個自然日）等方式，對標準進行廣泛征求意見。共收到XX家單位的反饋意見，其中有意見和建議的XX家單位，共提出了XX條意見和建議，反饋意見匯總表見附件。二、標準編制原則和主要內(nèi)容2.1標準編制原則本標準的制定符合產(chǎn)業(yè)發(fā)展的原則。本著先進性、科學性、合理性和可操作性的原則，以及標準的目標、統(tǒng)一性、協(xié)調(diào)性、適用性、一致性和規(guī)范性原則來進行本標準的制定工作。本標準是按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準的結(jié)構(gòu)和編寫》和GB/T20001.4-2015《標準編寫規(guī)則第4部分：試驗方法標準》的要求編寫的。2.2標準研制背景乙二胺四乙酸（EDTA）、氮川三乙酸（NTA）和二乙烯三胺五乙酸（DTPA）是一類理想的絡合劑，能與多數(shù)金屬形成絡合物，乙二胺四乙酸二鈉、氮川三乙酸三鈉和二乙烯三胺五乙酸五鈉是它們常見的形式被廣泛應用于洗滌劑生產(chǎn)工業(yè)中。但乙二胺四乙酸和二乙烯三胺五乙酸及其鹽在環(huán)境中難以被生物降解，氮川三乙酸及其鹽也被列為潛在的致癌物質(zhì)。在歐盟的2002/371/EC《歐盟委員會就制定關于授予紡織品共同體生態(tài)標簽的生態(tài)規(guī)范以及修訂1999/178/EC號決議通過的決議》、2003/200/EC《歐盟委員會關于為向洗滌用品頒發(fā)的共同體環(huán)保標識制定修訂后的環(huán)保標準以及修訂1999/476/EC號決議的決議》、2005/342/EC《歐盟委員會關于制定授予手洗餐具洗滌劑共同體環(huán)保標簽的修訂生態(tài)標準的決議》、美國的GS-41《工業(yè)和機構(gòu)用洗手液及洗手肥皂》、新西蘭的EC-01-16《手洗餐具用洗滌劑牌照準則》、澳大利亞的GECA16《家用機洗餐具用洗滌劑》等標準都明確提出禁用EDTA、NTA和DTPA及其鹽類物質(zhì)，我國HJ458-2009《環(huán)境標志產(chǎn)品技術要求家用洗滌劑》中也明確規(guī)定禁用氮川三乙酸及其鹽（NTA）作原材料，CSC/T2224-2006《洗滌類產(chǎn)品環(huán)保產(chǎn)品認證技術要求》規(guī)定個人衛(wèi)生洗滌劑、餐具洗滌劑、居室用洗滌劑產(chǎn)品禁止添加EDTA和NTA。因此，研究建立一種科學準確的洗滌用品中EDTA、NTA和DTPA及其鹽的分析測試方法對該類產(chǎn)品的質(zhì)量提升和安全性監(jiān)控具有重要意義。目前，針對國內(nèi)外有關EDTA、NTA和DTPA及其鹽的檢測方法主要有滴定法、高效液相色譜法、離子色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、衍生-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等，主要涉及在食品、醫(yī)藥、環(huán)境等領域。洗滌用品的相關檢測方法標準主要有SN/T4948-2017和GB/T13173-2008，分別采用離子色譜法和滴定法對洗滌用品中氮川三乙酸和乙二胺四乙酸進行測定。因此，本標準擬建立一種能同時檢測洗滌用品中乙二胺四乙酸、氮川三乙酸和二乙烯三胺五乙酸的分析方法，該方法精密度好，準確度高，可為質(zhì)量監(jiān)管部門開展產(chǎn)品質(zhì)量安全性監(jiān)控提供有力的技術支撐。2.3標準的技術路線和確定依據(jù)2.3.1主要技術路線主要技術路線圖見圖1。圖1主要技術路線圖2.3.2化合物信息乙二胺四乙酸、氮川三乙酸和二乙烯三胺五乙酸對照物質(zhì)的信息和結(jié)構(gòu)式見表1。表1對照物質(zhì)的信息和結(jié)構(gòu)式序號中文名稱英文名稱CAS號分子式相對分子質(zhì)量化學結(jié)構(gòu)式1乙二胺四乙酸二鈉Ethylenediaminetetraaceticaciddisodium

dihydrate6381-92-6C10H14N2Na2O8·2H2O372.242氮川三乙酸三鈉Nitrilotriaceticacidtrisodiumsaltmonohydrate18662-53-8N(CH2COONa)3·H2O275.103二乙烯三胺五乙酸五鈉Diethylenetriaminepentaaceticacidpentasodiumsalt140-01-2C14H18N3Na5O10503.262.3.3前處理條件的優(yōu)化2.3.3.1衍生化試劑的選擇通過文獻調(diào)研，EDTA與金屬離子（摩爾比為1:1）形成螯合物的條件穩(wěn)定常數(shù)順序為Fe3+>Sn3+>Cu2+>Ni2+>Pb2+>Zn2+>Co2+>Cd2+>Fe2+>Mn2+>Ca2+>Mg2+>Ba2+，NTA與金屬離子（摩爾比為1:1）形成螯合物的條件穩(wěn)定常數(shù)順序為Fe3+>Cu2+>Ni2+>Sn3+>Pb2+>Zn2+>Co2+>Cd2+>Fe2+>Mn2+>Ca2+>Mg2+>Ba2+，DTPA與金屬離子（摩爾比為1:1）形成螯合物的條件穩(wěn)定常數(shù)順序為Fe3+>Sn3+>Cu2+>Ni2+>Pb2+>Zn2+>Co2+>Cd2+>Fe2+>Mn2+>Ca2+>Mg2+>Ba2+，可見Fe3+與EDTA、NTA和DTPA均能形成穩(wěn)定的絡合物且穩(wěn)定系數(shù)較大，因此本方法選取Fe3+作為衍生化試劑。2.3.3.2衍生化反應時間分別移取1000mg/L的EDTA、1000mg/L的NTA和1000mg/L的DTPA儲備液各1mL至50mL比色管中，加入1.0mL0.1mol/LFe(NO3)3溶液和40mL水，混勻后在25℃條件下分別超聲10min、20min、30min、45min、60min，冷卻至室溫后加水至刻度，取適量溶液進行測試，比較目標物峰面積大小，結(jié)果見圖2?？梢?，超聲20min后衍生化反應基本完全反應。圖2超聲時間對目標物色譜峰面積的影響2.3.3.3衍生化反應溫度分別移取1000mg/L的EDTA、1000mg/L的NTA和1000mg/L的DTPA儲備液各1mL至50mL比色管中，加入1.0mL0.1mol/LFe(NO3)3溶液和40mL水，混勻后分別放置于25℃、45℃、60℃、80℃條件下超聲20min后進行測試，其結(jié)果如圖3。從圖中可見，衍生化反應在常溫25℃下超聲20min，其測試結(jié)果沒有明顯差異。圖3反應溫度對目標物色譜峰面積的影響2.3.3.4衍生化試劑的量分別移取1000mg/L的EDTA、1000mg/L的NTA和1000mg/L的DTPA儲備液各1mL至50mL比色管中，分別添加0.02mol/L、0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、Fe(NO3)3溶液1.0mL，常溫下超聲20min后取樣測試，結(jié)果見圖4，從圖中可以看出當加入1.0mL0.1mol/LFe(NO3)3衍生化反應已基本反應完全。繼續(xù)增加Fe(NO3)3溶液的濃度時，F(xiàn)e3+離子過量，在色譜圖中出現(xiàn)較大的Fe3+離子峰，影響基線，如圖5所示。由于Fe3+離子在pH1~4時較穩(wěn)定，同時與絡合劑的衍生化反應后的產(chǎn)物穩(wěn)定性較高，所以在Fe(NO3)3溶液中添加鹽酸至0.1moL/L，使溶液保持穩(wěn)定和衍生化順利進行。圖4衍生化試劑的量對目標物色譜峰面積的影響圖5衍生化試劑的量對色譜圖的影響綜合以上實驗數(shù)據(jù)分析，選用0.1mol/LFe(NO3)3含0.1mol/L鹽酸溶液作為衍生化試劑。本方法EDTA、NTA和DTPA的衍生條件為：加1.0mL0.1mol/LFe(NO3)3含0.1mol/L鹽酸溶液在常溫條件下超聲20min。2.3.3.5凈化過程的優(yōu)化（存在干擾時）經(jīng)文獻調(diào)研，由于EDTA、NTA和DTPA衍生物是以FeEDTA-、FeNTA-和FeDTPA-的形式存在，因此可選用陰離子交換柱對樣品進行凈化處理。本方法選用WatersOasisMAX混合型陰離子交換固相萃取小柱對樣品進行凈化，并對洗脫溶劑選擇進行優(yōu)化。MAX混合型陰離子交換柱固定相中帶正電荷的季銨基與帶負電荷的目標物通過離子作用增強對分析物的反相保留效果，在洗脫過程中通常需調(diào)節(jié)pH值中和分析物的電荷，才能將目標物從色譜柱順利洗脫下來。本方法選取甲酸-甲醇-水體系作為洗脫溶劑考察不同甲酸比例對回收率的影響，分別比較了5mL不同體積比的甲酸-甲醇-水=2:50:48、5:50:45、8:50:42、10:50:40、15:50:35的洗脫效果，結(jié)果如圖6，可見當甲酸比例低于10%時，目標物難以被洗脫完全，需要消耗更多溶劑且耗時長，而用甲酸高于10%時，目標物則洗脫較快難以達到理想的凈化效果，因此選取5mL甲酸-甲醇-水=10:50:40作為本實驗的洗脫溶液較為適宜。圖6甲酸溶液比例對目標物回收率的影響2.3.3.6最終確定樣品前處理條件提取：準確稱取1.0g樣品（精確到0.001g）至50mL的比色管中，加入40mL超純水溶解，渦旋1min，待衍生化。衍生：向提取溶液鐘加入1.0mL0.1mol/L的硝酸鐵溶液（含0.1mol/L鹽酸），渦旋混勻，超聲20min，冷卻至室溫后，加水定容至刻度，混勻，過0.45μm濾膜，待測。凈化（必要時）：準確移取5mL衍生化溶液，經(jīng)依次用5mL甲醇、5mL水活化的MAX陰離子交換柱，控制流速1~2mL/min，依次用5mL水、5mL甲醇淋洗，待淋洗液流盡，最后用5mL甲酸-甲醇-水（10+50+40）洗脫，收集洗脫液。將洗脫液經(jīng)80℃氮吹干，冷卻至室溫，加水溶解定容至5mL，過0.45μm濾膜，待測。2.3.4色譜條件的優(yōu)化2.3.4.1色譜柱的選擇本方法分別考察了NUCLEOSIL100-5SB、SyncronisHilic、WatersXBridgeC18三種色譜柱對EDTA、NTA和DTPA衍生化溶液的分離效果，結(jié)果表明NUCLEOSIL100-5SB、SyncronisHilic難以得到較好的色譜峰型，而WatersXBridgeC18具有較好的分離效果，且色譜峰型良好，因此本方法選擇WatersXBridgeC18作為分離色譜柱。2.3.4.2流動相的選擇本方法基于WatersXBridgeC18分離色譜柱對流動相進行優(yōu)化，根據(jù)文獻查詢，主要對比了“V（甲醇）：V（四丁基氫氧化銨甲醇溶液）(pH=7.5)”、“V(甲醇)∶V(四丁基溴化銨-醋酸鈉混合溶液)(pH=4.0)”和“V(甲醇)∶V(四丁基溴化銨-醋酸鈉混合溶液)(pH=3.5)”三種流動相。結(jié)果表明，采用V(甲醇)∶V(四丁基溴化銨-醋酸鈉混合溶液)能得到較好的色譜峰型，pH對保留時間影響較大，pH越大保留時間越長，但pH過大易造成峰展寬和衍生物不穩(wěn)定，采用V（甲醇）：V（四丁基氫氧化銨甲醇溶液），難以得到理想的色譜峰型，調(diào)節(jié)pH后也不理想，可能的原因是目標物在該條件下穩(wěn)定性差，與色譜柱填料間的作用力加大難以洗脫，因此本方法選擇5mmol/L四丁基溴化銨+50mmol/L醋酸鈉+5%甲醇（醋酸pH至4.0）作為流動相。2.3.4.3最大吸收波長的選擇將EDTA、NTA和DTPA衍生化的混合標準溶液進行210-400nm波長的全掃描，其光譜圖如圖7所示，可見三種衍生物的最大吸收波長在260nm附近，所以選取260nm的檢測波長，三者均能得到理想的色譜圖。圖7EDTA、NTA和DTPA衍生物的210-400nm波長等吸收圖2.3.4.4最終確定的儀器分析條件通過進一步選擇、優(yōu)化色譜條件，得到最終的液相色譜分析參考條件：色譜柱：C18柱，柱長250mm，內(nèi)徑4.6mm，粒徑5μm，或柱效相當?shù)纳V柱；流動相：5mmol/L四丁基溴化銨+50mmol/L醋酸鈉+5%甲醇（醋酸pH至4.0）；柱溫：30℃流量：1.0mL/min；進樣量：20μL。檢測波長：260nm。典型標準溶液、樣品溶液和空白溶液的高效液相色譜圖見圖8-10。圖8乙二胺四乙酸、氮川三乙酸和二乙烯三胺五乙酸衍生物的標準HPLC色譜圖圖9實際樣品的HPLC色譜圖圖10空白樣品的HPLC色譜圖2.4解決的主要問題本方法通過優(yōu)化目標化合物的液相色譜參數(shù)，以及對不同類型樣品的衍生前處理方法條件進行摸索，最終建立了一套標準性的檢測方法，解決的主要問題包括：（1）確定了液相色譜儀的檢測參數(shù)，包括色譜柱、流動相、檢測波長等；（2）確定了衍生前處理方法，包括衍生試劑、衍生溫度、衍生時間、衍生試劑用量以及凈化條件的選擇；（3）完成了方法學的考察，包括線性范圍、方法檢出限和定量限、回收率和精密度、方法穩(wěn)定性等；（4）完成了方法的適用性試驗，對市售洗滌劑樣品進行了檢測。2.5修訂標準時應列出與原標準的主要差異和水平對比該標準屬首次起草，無與原標準的主要差異和水平對比。三、主要試驗（或驗證）情況分析、綜述結(jié)論3.1試驗分析3.1.1標準曲線的配制和線性關系標準儲備溶液，1000mg/L（以酸計）：分別準確稱取適量乙二胺四乙酸二鈉、氮川三乙酸三鈉和二乙烯三胺五乙酸五鈉對照物質(zhì)，分別用水溶解并定容至100mL棕色容量瓶中，混勻。標準工作溶液：分別移取適量的標準儲備液配制系列不同濃度的標準溶液，在優(yōu)化的條件下，對乙二胺四乙酸、氮川三乙酸和二乙烯三胺五乙酸衍生物進行測定，分別以濃度為橫坐標，對應峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線，結(jié)果見表2。表2線性方程、線性范圍、相關系數(shù)化合物線性范圍（mg/L）線性方程相關系數(shù)(r)乙二胺四乙酸0.5-50.0Y=27.565X-1.2180.9999氮川三乙酸1.0-50.0Y=25.689X-1.5250.9994二乙烯三胺五乙酸1.0-50.0Y=19.877X-1.8770.9996結(jié)果表明，在0.5mg/L~50.0mg/L范圍內(nèi)，乙二胺四乙酸衍生物呈現(xiàn)良好的線性關系；在1.0mg/L~50.0mg/L范圍內(nèi)，氮川三乙酸和二乙烯三胺五乙酸衍生物呈現(xiàn)良好的線性關系。3.1.2檢出限和定量限選擇空白樣品，定量添加乙二胺四乙酸、氮川三乙酸和二乙烯三胺五乙酸標準溶液，按照最終確定的方法步驟，考察方法的測定低限。將所得譜圖的信噪比大于3時乙二胺四乙酸、氮川三乙酸和二乙烯三胺五乙酸的添加量定為方法的檢出限，將所得譜圖的信噪比大于10時乙二胺四乙酸、氮川三乙酸和二乙烯三胺五乙酸的添加量定為方法的定量限。結(jié)果表明，本方法中乙二胺四乙酸的檢出限為10mg/kg，定量限均25mg/kg；氮川三乙酸和二乙烯三胺五乙酸的檢出限均為25mg/kg，定量限均為50mg/kg。3.1.3回收率和精密度平行稱取洗滌劑空白樣品各6份，每份約1g，共三組，分別定量加入乙二胺四乙酸、氮川三乙酸和二乙烯三胺五乙酸混合標準溶液。乙二胺四乙酸的添加水平分別為0.5mg/L、5.0mg/L、50.0mg/L，氮川三乙酸和二乙烯三胺五乙酸的添加水平分別為1.0mg/L、10.0mg/L、50.0mg/L，按試樣處理方法處理后進行測定，結(jié)果見表3。從表中可看出，乙二胺基四乙酸不同濃度下的平均加標回收率為92.8~100.3%，相對標準偏差為1.81~2.95%（n=6）；氮川三乙酸不同濃度下的平均加標回收率為92.8~101.1%，相對標準偏差為2.04~3.86%（n=6）；二乙烯三胺五乙酸不同濃度下的平均加標回收率為96.0~100.7%，相對標準偏差為1.44~2.76%（n=6）。結(jié)果表明，本方法具有良好的回收率和精密度，滿足相關定量分析要求。表3樣品加標回收率測定結(jié)果（n=6）化合物添加量(mg/L)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)123456乙二胺四乙酸0.595.693.492.190.592.592.792.81.815.0102.8101.398.596.796.997.298.92.5950.0103.799.3102.697.2102.396.8100.32.95氮川三乙酸1.090.291.394.592.393.195.692.82.165.099.299.696.898.4102.8100.699.62.0450.097.998.699.198.8106.5105.7101.13.86二乙烯三胺五乙酸1.095.694.397.694.596.797.196.01.4410.096.597.595.693.896.798.596.41.68100.0102.6101.3100.696.598.7104.3100.72.76取濃度為1mg/L與50mg/L的標準工作溶液各連續(xù)進樣6次，得到峰面積，峰面積的RSD作為標準溶液的日內(nèi)精密度。將濃度為1mg/L與50mg/L標準工作溶液連續(xù)三天每天連續(xù)進樣6次，作為標準溶液的日間精密度。日內(nèi)、日間精密度結(jié)果見表4。表4精密度試驗結(jié)果（n=6）濃度峰面積1μg/mL50μg/mL化合物EDTANTADTPAEDTANTADTPA第一天127.125.619.213541296972226.826.320.113681325985326.524.718.7134712681005425.825.219.513781282956528.325.919.413571290978627.524.518.513281288994日內(nèi)精密度RSD（%）3.182.753.011.281.471.75第二天726.524.818.613701282965825.425.519.813541318968925.923.917.91335127810101026.624.718.8132412549421127.824.619.6136312899541225.725.519.2131812761004第三天1327.623.818.1132812759461425.825.719.5135713149681525.124.318.2133812589941626.825.218.5135212669761727.524.219.6134412749681826.524.817.613121268979日間精密度RSD（%）1.301.471.730.640.610.53結(jié)果表明，濃度為1mg/L與50mg/L標準工作溶液的日內(nèi)、日間精密度良好。3.1.4穩(wěn)定性取加標濃度為1mg/L與50mg/L的樣品溶液，常溫（25℃）放置3d，分別于0h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h進行測定，將測得峰面積代入標準曲線計算被測物質(zhì)的濃度，計算濃度值的RSD以考察被測物質(zhì)在日內(nèi)和三日間的穩(wěn)定性。化合物的日內(nèi)、日間穩(wěn)定性結(jié)果見表5。結(jié)果表明，加標濃度為1mg/L與50mg/L樣品溶液的日內(nèi)、日間精密度良好。表5穩(wěn)定性試驗結(jié)果加標濃度（μg/mL）化合物實測濃度（μg/mL）日內(nèi)RSD（%）實測濃度（μg/mL）日間RSD（%）放置0h放置2h放置4h放置8h放置12h放置24h放置48h放置72h1EDTA1.0160.99