實時熒光定量PCR定義在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)

ContentsClicktoaddtitleinhere123實時熒光定量PCR原理實時熒光定量PCR的方法介紹實時熒光定量PCR的應(yīng)用實時熒光定量PCR定義：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實現(xiàn)了實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，對起始模板進(jìn)行定量分析的方法。與普通PCR的區(qū)別普通PCR技術(shù)實時定量PCR技術(shù)在PCR結(jié)束后對終點產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。實時檢測PCR擴(kuò)增，在擴(kuò)增的指數(shù)期對起始模板進(jìn)行定量。相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點處產(chǎn)物量不恒定；Ct值則極具重現(xiàn)性。Ct值的定義：

擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。此時擴(kuò)增是呈對數(shù)期增長。Ct值定量PCR的數(shù)學(xué)原理?理想的PCR反應(yīng)：X=X0*2n?非理想的PCR反應(yīng)：X=X0(1+Ex)nn：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0：初始模板量Ex：擴(kuò)增效率在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值線時:XCt=X0(1+Ex)Ct=M(1)XCt:熒光擴(kuò)增信號達(dá)到閾值強(qiáng)度時擴(kuò)增產(chǎn)物的量。

在閾值線設(shè)定以后,它是一個常數(shù),我們設(shè)為M方程式(1)兩邊同時取對數(shù)得:logM=logX0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:logX0=-log(1+Ex)*Ct+logM(3)最后結(jié)論：LogX0與Ct呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增的Ct值就可計算出樣品中所含的模板量。

Log起始拷貝量與Ct呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量。標(biāo)準(zhǔn)曲線

實時熒光定量PCR的方法介紹

DNA產(chǎn)物的熒光標(biāo)記非特異性熒光標(biāo)記：1、SYBRGreen特異性熒光標(biāo)記：2、TaqMan3、MolecularBeaconSYBRGreen法工作機(jī)理SYBRGreen只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光。變性時，DNA雙鏈分開，無熒光。在延伸結(jié)束階段采集熒光信號。SYBRGreen也能和非特異的雙鏈DNA結(jié)合發(fā)光，所以必須在反應(yīng)結(jié)束時做熔解曲線分析。

SYBRGreen熔解曲線分析

融解曲線分析，單一峰，無非特異性熒光，定量準(zhǔn)確融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準(zhǔn)確SYBRGreen法優(yōu)缺點優(yōu)點缺點對DNA模板沒有選擇性--適用于任何DNA使用方便--不必設(shè)計復(fù)雜探針非常靈敏便宜容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性，但可以通過融解曲線的分析，優(yōu)化反應(yīng)條件對引物特異性要求較高TaqMan法5′端標(biāo)記有報告基團(tuán)(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針TaqMan法工作原理每擴(kuò)增一條DNA分子，釋放一個熒光信號

TaqMan法PCR反應(yīng)的建立

引物、探針的設(shè)計：探針Tm為68-70℃，<30bp,5’不能有G，G可能會淬滅熒光素，引物盡量靠近探針，擴(kuò)增片段<400bp，引物Tm為59-60℃反應(yīng)參數(shù)的確定：一般為：95℃,3min、94℃，15S、60℃，60S（Taq酶5′→3′外切酶活性在60℃最高也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度）優(yōu)化引物和探針濃度：引物濃度：50-900nM探針濃度：50-250nM其他與常規(guī)PCR相同TaqMan法優(yōu)缺點優(yōu)點缺點對目標(biāo)序列的高特異性--陰性結(jié)果確定引物設(shè)計相對簡單重復(fù)性比較好只適合一個特定的目標(biāo)委托公司標(biāo)記，價格較高熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用絕對定量基因表達(dá)研究轉(zhuǎn)基因食品檢測相對定量基因在不同樣本中的表達(dá)差異藥物療效考核陰陽性分析病原體（HBV，HCV等）檢測禽流感檢測等位基因分型SNP分析與疾病相關(guān)的等位基因點突變檢測拓展應(yīng)用MicroRNA分析基因拷貝數(shù)分析表觀遺傳學(xué)分析蛋白質(zhì)分析腫瘤稀有突變檢測

兩種定量的不同方法

絕對定量檢測起始模板數(shù)的精確拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法相對定量是確定經(jīng)過不同處理的樣本之間基因的表達(dá)差異

2-△△Ct

雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法優(yōu)點：給出的是目標(biāo)基因的絕對數(shù)量，數(shù)據(jù)容易處理缺點：必須有標(biāo)準(zhǔn)品；標(biāo)準(zhǔn)品必須準(zhǔn)確測定，難以制備和質(zhì)控絕對定量相對定量優(yōu)點：不需要知道模板的確切拷貝數(shù)。可以不做標(biāo)準(zhǔn)品；標(biāo)準(zhǔn)品容易制備；使用廣泛缺點：數(shù)據(jù)處理比較麻煩，數(shù)據(jù)理解困難相對定量——ΔΔCt法相對定量——相對標(biāo)準(zhǔn)曲線