物理方法誘導(dǎo)細(xì)胞融合的進(jìn)展

物理方法誘導(dǎo)細(xì)胞融合的進(jìn)展一.細(xì)胞融合簡介二.傳統(tǒng)物理融合方法三.其他物理融和方法細(xì)胞融合技術(shù)是近年來迅速發(fā)展起來的一項(xiàng)新興細(xì)胞工程技術(shù)，在外力（誘導(dǎo)劑或促融劑）作用下，2個(gè)或2個(gè)以上的異源（種、屬間）細(xì)胞或原生質(zhì)體相互接觸，從而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合，并形成雜種細(xì)胞的現(xiàn)象稱為細(xì)胞融合（cellfusion）或細(xì)胞雜交。(cellhybridization)它是利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，把來自于不同種生物的單個(gè)細(xì)胞融合成1個(gè)細(xì)胞，這個(gè)新細(xì)胞（雜合細(xì)胞）得到了來自2個(gè)細(xì)胞的遺傳物質(zhì)（包括細(xì)胞核的染色體組合和核外基因），將具有新的遺傳學(xué)或生物學(xué)特性。細(xì)胞融合技術(shù)作為細(xì)胞工程的核心基礎(chǔ)技術(shù)之一,已在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域取得了開創(chuàng)性的研究成果,而且應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大。細(xì)胞融合技術(shù)不僅為核質(zhì)關(guān)系、基因調(diào)控、遺傳互補(bǔ)、細(xì)胞免疫學(xué)、腫瘤發(fā)生、基因定位、衰老控制等理論領(lǐng)域的研究提供了有力的手段,而且被廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、遺傳學(xué)、發(fā)生生物學(xué),特別是在單克隆抗體及動(dòng)植物遠(yuǎn)緣雜交育種等方面具有十分重要的意義。隨著細(xì)胞融合技術(shù)研究的不斷深入,細(xì)胞融合技術(shù)的發(fā)展前景及其產(chǎn)生的影響將日益顯著。

細(xì)胞融合方法有生物法、化學(xué)法和物理法，其中生物方法因病毒制備困難、操作復(fù)雜、滅活病毒的效價(jià)差異大、實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性差、融合率很低等。目前，這種方法主要適用于動(dòng)物細(xì)胞融合，用于實(shí)驗(yàn)室?；瘜W(xué)法因?yàn)榇嬖趯?duì)細(xì)胞損傷大、殘存毒性、融合率較低及經(jīng)驗(yàn)性大等缺陷，目前應(yīng)用也不廣。而物理方法因融合頻率高，是PEG的100倍；操作簡便、快速；對(duì)細(xì)胞無毒；可在鏡下觀察融合過程

等優(yōu)點(diǎn)，顯示出強(qiáng)大的生命力。

二.傳統(tǒng)物理方法1.電融合法2.激光融合法1.電融合法

電融合誘導(dǎo)法是指利用電場(chǎng)來誘導(dǎo)細(xì)胞彼此連接成串，在施加瞬間強(qiáng)脈沖促使質(zhì)膜發(fā)生可逆性電擊穿，促使細(xì)胞融合的方法。

自從1978年Zimmermann首先采用電脈沖方法成功地誘導(dǎo)了細(xì)胞電穿孔、電融合以來近三十年里,電穿孔和電融合技術(shù)不斷發(fā)展完善成為一門比較成熟的學(xué)科,得到非常廣泛地應(yīng)用。

1983～1988年期間,以Zimmermann為主的工作小組通過動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞電融合實(shí)驗(yàn)得出高頻短脈沖是可行的。并且認(rèn)為高頻短脈沖電信號(hào)可以用于細(xì)胞操控、基因工程和細(xì)胞融合,證明了利用電場(chǎng)這一物理因素誘導(dǎo)細(xì)胞融合具有普遍的適用性。由于電融合的可控性,使人們第一次在顯微鏡下直接觀察細(xì)胞的融合過程,且電極間細(xì)胞的融合率高達(dá)10～80%。

1991年Naton等提出利用融合對(duì)象間密度的差異來實(shí)現(xiàn)融合時(shí)的有序隊(duì)列。在兩電極間放入合適密度的媒質(zhì),混合的兩種類型的原生質(zhì)體就會(huì)形成兩個(gè)不同的單層結(jié)構(gòu);在此情況下,可以獲得很高的異核融合產(chǎn)率。融合率取決于所加電場(chǎng)的方向,如果接觸區(qū)域是建立在陽極面,那么融合率就會(huì)比建立在陰極面提高兩倍。他們采用的實(shí)驗(yàn)樣本是美洲狼尾草葉肉細(xì)胞和煙草葉肉細(xì)胞的原生質(zhì)體。

1993年俄羅斯研究人員Abidor等采用了一種新的方式來研究細(xì)胞融合和高電場(chǎng)中細(xì)胞膜的電學(xué)特性。他們將L929細(xì)胞和其它的四種類型細(xì)胞的懸浮液放入特殊的腔室中,通過離心力作用將細(xì)胞緊壓同時(shí)所測(cè)量緊壓體系的電阻值間接地發(fā)映出離心過程中狀態(tài)的變化情況,并通過對(duì)比試驗(yàn)揭示出膜接觸程度的近與遠(yuǎn)是影響細(xì)胞融合率高與低的關(guān)鍵因素。

2000年Mekid等首次報(bào)道了電場(chǎng)作用下組織中發(fā)生細(xì)胞電融合過程,他們采用B16鼠科黑素瘤組織,在不施加和施加500V/cm,1350V/cm,2000V/cm等不同場(chǎng)強(qiáng)條件下,得到了電融合后的細(xì)胞并通過相互對(duì)比得出高場(chǎng)強(qiáng)作用下融合過程比較明顯的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。雖然此時(shí)細(xì)胞融合率已經(jīng)比較高,但是電極間距離仍然屬于毫米級(jí),所以在進(jìn)行細(xì)胞電融合時(shí),電壓必須提高到300V以上才能夠達(dá)到細(xì)胞電融合所需的電場(chǎng)強(qiáng)度。此外,融合裝置體積比較大但是細(xì)胞融合通量較低,這些不利因素都限制了細(xì)胞電融合的推廣。

2004年日本東京大學(xué)的研究人員采用硅電極、玻璃與PDMS相結(jié)合的微流控芯片制作出了高縱橫比的電極,并且采用低電壓技術(shù)實(shí)現(xiàn)了高效的細(xì)胞融合,融合率達(dá)到75%。

2007年Jongil等在“芯片實(shí)驗(yàn)室”水平上通過電融合手段,實(shí)現(xiàn)了對(duì)日本美口菌和珊瑚菜的電融合過程。他們的芯片是由玻璃作為基底,PDMS通過鑄模方式實(shí)現(xiàn)微流控通道的制作然后利用等離子鍵合使上下兩層緊密結(jié)合,很大程度上提高了細(xì)胞1:1的對(duì)準(zhǔn)并發(fā)生融合的概率。在交流電壓1～2MHz峰峰值8～10V的矩形脈沖作用下實(shí)現(xiàn)排隊(duì)過程;然后采用周期為10～100毫秒幅值為250mV的直流脈沖來控制和保持融合。此外,該課題組對(duì)電極電場(chǎng)分布進(jìn)行了仿真。同年Wang等采用微流控電穿孔技術(shù),制造了PDMS彈性閥。當(dāng)施加直流電壓脈沖時(shí),PDMS閥能夠?qū)崿F(xiàn)快速關(guān)斷產(chǎn)生電壓脈沖序列。在此條件下的細(xì)胞融合芯片中的細(xì)胞,能夠進(jìn)行排隊(duì)及融合。而且此技術(shù)解決了制造電極和高電壓脈沖電源的難度問題。

2.激光融合法

20世紀(jì)80年代中期又發(fā)明了激光融合器,迅速崛起的激光誘導(dǎo)細(xì)胞融合術(shù)是利用激光微束對(duì)相鄰細(xì)胞接觸區(qū)的細(xì)胞膜進(jìn)行破壞(或擾動(dòng)),可將兩個(gè)不同特性、不同大小的細(xì)胞在顯微鏡下實(shí)現(xiàn)融合。即利用光鑷捕捉并拖動(dòng)一個(gè)細(xì)胞使之靠近另一個(gè)細(xì)胞并緊密接觸,然后對(duì)接觸處進(jìn)行脈沖激光束處理,使質(zhì)膜發(fā)生光擊穿,產(chǎn)生微米級(jí)的微孔。這樣,由于質(zhì)膜上微孔的可逆性,細(xì)胞開始變形融合,最終成為一個(gè)細(xì)胞。

1987年和1989年德國海德堡理化研究所用準(zhǔn)分子激光器使油菜原生質(zhì)體融合,從開始照射到完成融合僅需幾秒鐘,對(duì)融合產(chǎn)物觀測(cè),發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)仍在運(yùn)動(dòng),說明融合后的細(xì)胞仍能存活。激光微束融合法與以前的病毒法、PEG法、電融合法相比較,可選擇任意兩個(gè)細(xì)胞進(jìn)行融合,易于實(shí)現(xiàn)特異性細(xì)胞融合,作用于細(xì)胞的應(yīng)力小,定時(shí)、定位性強(qiáng),損傷小,參數(shù)易于控制,操作方便,可利用監(jiān)控器清晰地觀察整個(gè)融合過程,實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好,無菌,無毒性。

但它只能逐一處理細(xì)胞,不能像其他方法一樣同時(shí)處理大量細(xì)胞。細(xì)胞間相互接觸是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞融合的前提,目前,最新穎的方法是利用激光光阱建立兩細(xì)胞間接觸,即光鑷(poticaltweezers)利用激光高斯光束光場(chǎng)的梯度力把細(xì)胞從光束邊緣拉向光束中間,在光斑直徑與光波波長尺度相比擬時(shí),指向束腰的軸向梯度力要大于沿光束方向的散射力,該梯度力把細(xì)胞豎直地拉到激光束腰下方處,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的操作。

缺點(diǎn)三現(xiàn)代物理方法1.基于微流控芯片的細(xì)胞融合技術(shù)

2.高通量細(xì)胞融合芯片

3.空間細(xì)胞融合技術(shù)

4.離子束細(xì)胞融合技術(shù)

5.非對(duì)稱細(xì)胞融合技術(shù)

1.基于微流控芯片的細(xì)胞融合技術(shù)

隨著微機(jī)電系統(tǒng)（MEMS）技術(shù)和微加工技術(shù)的發(fā)展，微電極陣列的設(shè)計(jì)加工制作也日趨成熟，加之微通道網(wǎng)絡(luò)可以整合到生物芯片之上，這將使得微流控系統(tǒng)成為細(xì)胞融合的理想平臺(tái)，利用微流控系統(tǒng)可以按照預(yù)定的要求大量融合異種細(xì)胞。目前，基于微流控芯片的細(xì)胞融合技術(shù)已成為細(xì)胞融合技術(shù)研究的重點(diǎn)領(lǐng)域。利用基于芯片技術(shù)的微流控系統(tǒng)不僅可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞甚至單個(gè)細(xì)胞的操控，比如轉(zhuǎn)移、定位、變形等，也可以同時(shí)輸送、合并、分離和分選大量細(xì)胞，細(xì)胞融合在芯片上可以通過并行或快速排隊(duì)的方式實(shí)現(xiàn)。此外由于在微通道內(nèi)的腔體容積很小，所以會(huì)大幅減少細(xì)胞融合中所需的細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)細(xì)胞融合率和雜合細(xì)胞的成活率會(huì)大大提高。

2.高通量細(xì)胞融合芯片

高通量細(xì)胞融合芯片利用微電極陣列在微米范圍內(nèi)（10-40微米）產(chǎn)生的高強(qiáng)度、高梯度輻射電場(chǎng)，使得細(xì)胞在特殊輻射電場(chǎng)的作用下產(chǎn)生介電質(zhì)電泳力，精確處理和刺激預(yù)定的目標(biāo)細(xì)胞，從而使目標(biāo)細(xì)胞按照預(yù)先設(shè)計(jì)的方向（可以是任何預(yù)先設(shè)計(jì)好的方向）以預(yù)定的速度（可以是不同種的細(xì)胞以不同的速度定向）移動(dòng)，從而按照設(shè)計(jì)要求準(zhǔn)確地、大批量地得到目標(biāo)細(xì)胞配型，集成微電極陣列的微流控系統(tǒng)，可以方便靈活地實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的操作、隔離和轉(zhuǎn)移。由于在微通道內(nèi)微電極間距可以做得很小，因此獲得同樣強(qiáng)度的輻射電場(chǎng)強(qiáng)度只需施加較低電壓的交變電場(chǎng)和脈沖即可，不用加載昂貴的高電壓發(fā)生裝置。高通量細(xì)胞融合芯片可以與化學(xué)誘導(dǎo)融合、電誘導(dǎo)融合等方法相互結(jié)合，比如：在細(xì)胞融合緩沖液中加入少量的PEG可大大提高細(xì)胞的融合率。此外，二價(jià)陽離子（例如：鈣離子）以及蛋白酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，融合率也可大幅提高。然而，截至目前各國與此相關(guān)的細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)工作只有幾篇文章見諸報(bào)端，許多構(gòu)想也只是在理論層次上的探討。3.空間細(xì)胞融合技術(shù)

由于地球引力的存在，有液泡的原生質(zhì)體與無液泡的原生質(zhì)體的密度差加大，異源細(xì)胞間的融合得率十分有限。在利用動(dòng)物細(xì)胞融合生產(chǎn)單克隆抗體過程中，由于無法排除地球引力的影響，要提高淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的融合得率相當(dāng)困難。20世紀(jì)80年代以來，人們?cè)诳臻g材料科學(xué)的啟發(fā)下，試圖利用空間微重力條件改進(jìn)細(xì)胞融合技術(shù)。大量的飛行實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在微重力條件下酵母細(xì)胞的融合得率有很大的增加，融合得率增加主要是由于降低了重力沉降影響，而雜種細(xì)胞的活力增加可能是由細(xì)胞排列時(shí)間縮短引起的。在取得這些成功實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究融合后的細(xì)胞在空間培養(yǎng)的可能性已經(jīng)具備。

4.離子束細(xì)胞融合技術(shù)

雷電、輻射等自然過程中產(chǎn)生的低能離子可作用于生物體，20世紀(jì)80年代中期，中國科學(xué)院等離子體物理研究所的余增亮等人發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了離子注入生物效應(yīng)和粒子沉積生物效應(yīng)的存在，建立了質(zhì)量、能量、電荷三因子作用機(jī)制體系。在離子束與生物體相互作用中，粒子的植入、動(dòng)量的傳遞和電荷交換可導(dǎo)致細(xì)胞表面被刻蝕，引起細(xì)胞膜透性和跨膜電場(chǎng)的改變。據(jù)此原理，發(fā)展了離子束誘導(dǎo)細(xì)胞融合技術(shù)。此項(xiàng)研究改變傳統(tǒng)的一對(duì)一細(xì)胞融合的弊端，減少供體細(xì)胞導(dǎo)入的染色體范圍，使融合更具目的性，大大減少篩選的工作量，將是細(xì)胞融合研究的一大進(jìn)步。

5.非對(duì)稱細(xì)胞融合技術(shù)

非對(duì)稱細(xì)胞融合技術(shù)，是利用某種外界因素-常為γ射線，即γ融合.輻照某一細(xì)胞原生質(zhì)體，選擇性地破壞其細(xì)胞核，并用碘乙酰胺堿性蕊香紅6G處理在細(xì)胞核中含有優(yōu)良基因的第2種原生質(zhì)體，選擇性地使其細(xì)胞質(zhì)失活。然后融合來自這2個(gè)原生質(zhì)體品系的細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)所需胞質(zhì)和細(xì)胞核基因的優(yōu)化組合，或使前者被打碎的細(xì)胞核染色體片段中的個(gè)別基因滲入到后者原生質(zhì)體的染色體內(nèi)，實(shí)現(xiàn)有限基因的轉(zhuǎn)移，從而在保留親本之一全部優(yōu)良性狀的同時(shí)改良其某個(gè)不良性狀。

實(shí)踐表明，非對(duì)稱細(xì)胞融合技術(shù)通過γ射線照射，為實(shí)現(xiàn)供體親本少數(shù)基因的轉(zhuǎn)移，創(chuàng)造種間、屬間雜種，提供了可能性。值得注意的是，此方法特別適用于細(xì)胞質(zhì)雄性不