DB21T 2536-2015 副結(jié)核分支桿菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法

DB21DB21/T2536—2015副結(jié)核分支桿菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法Methodofthereal-timeRT-PCRfortheaviumsubsp.paratuberculosis遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。1本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了副結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumaviumsubssp.paratuberculosis）實(shí)時(shí)熒光PCR件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)DEPC：焦碳酸乙二酯（DiethylTaq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）RNA：核糖核酸（RibonucleicAci實(shí)時(shí)熒光PCR：熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RealTimeFluorescentQuantitativeReverseTranscriptionPolymeraseChainReactiTAMRA熒光素為淬滅熒光基團(tuán)（用Q表示），它在近距離內(nèi)能吸收5'端熒光基因發(fā)出的熒吸收，儀器檢測(cè)不到熒光信號(hào)；而反應(yīng)進(jìn)行到延伸階段時(shí)，Taq酶的5'到3'的外切核酸酶功能將探針降解。這樣探針上的R基團(tuán)游離出來，所發(fā)出的熒光不再為Q所吸收而被檢測(cè)儀所接收。隨著PCR反應(yīng)的循環(huán)進(jìn)行，PCR產(chǎn)物與熒光信號(hào)的增長呈現(xiàn)5試劑和材料2除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水；所有試劑均用無RNA5.1試劑5.1.2Triton-X-1005.1.4三氯甲烷。5.1.5檸檬酸鈉-磷酸鹽緩沖液：配制方法見附錄A.5.1.675%乙醇：配制方法見附錄A.3。5.1.84%氫氧化鈉：配制方法見附錄A.4。5.1.94%硫酸：配制方法見附錄A.）：）：制方法見附錄A.9，5%甘油：配制方法見附錄A.5.1.11dNTPMixture(各10mM)、EX-Taq酶(5U/μL)，UDG酶。5.1.12引物：以副結(jié)核F57基因序列合成一對(duì)特異性引物：上游引物5'5.2儀器與耗材5.2.1接種棒5.2.4微量移液器：0.5μL～10μL，5μL～20μL，20μL5.2.5組織勻漿器。5.3儀器與耗材6生物安全要求7.1.1培養(yǎng)物：直接取液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌液，對(duì)于在固體培養(yǎng)基上生長的菌37.1.2血樣：用無菌注射器或真空采血管，無菌自動(dòng)物靜脈采血，無7.1.4糞便：選取新鮮糞便（腹瀉或或有粘液、血），7.1.5組織：選取有明顯病變的腸段，回盲瓣以及?。?，），自上述完成前處理的樣品中加入100μlDNA提取液，充分振蕩混勻，55℃溫浴30min，98℃加熱10min，瞬時(shí)離心使液滴聚集管底，加等體積三氯甲烷，振蕩混勻，12000g離心5min，取上清。糞便樣品進(jìn)行以下步驟：加3倍體積異丙醇，顛倒混勻，放置5min；4℃15000g離心10min，棄上清，加3倍體積70%乙醇，振蕩洗滌；4℃15000g離心10min，棄上清，室溫干燥5min；加入50μl無DNA酶、無RNA酶），49結(jié)果判定9.1結(jié)果分析條件設(shè)定9.2質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)9.2.3如陰性對(duì)照和陽性對(duì)照條件不滿足以上條件，此實(shí)驗(yàn)視為無效。9.3結(jié)果描述及判定9.3.1陰性判定無Ct值并且無擴(kuò)增曲線，表明樣品中無副Ct值≤30，且出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，表示樣品中存在副結(jié)核分枝桿菌5A液(0.2mol/LNaH2PO4溶液)：稱取一水合磷酸二氫鈉(NaH2PO4·H20)27.6g,或二水合磷酸二氫鈉2PO420)31.2g，溶于蒸餾水中，定容至1L。稱取17g氯化鈉，用適量蒸餾水溶解，量取13mLA液和87mLB液，混合，用蒸餾水定容至2L。采用A.2檸檬酸鈉一磷酸緩沖液分別量取51mLA液、49mLB液，混合即成100mLpH6.稱取2.84g檸檬酸鈉(Na3C6H5O·2H2O)，加入100mLA.375％乙醇溶液量取75ml無水乙醇溶液，加入雙蒸水中，充分混勻，定容至100A.44％氫氧化鈉溶液稱取8g氫氧化鈉，加入雙蒸水，充分溶解,定容至200A.54％硫酸溶液98%的濃硫酸10ml，加入雙蒸水，定容至45A.650mmol/L氯化鉀（50mmol/LK稱取3.73g氯化鉀，加入雙蒸水，充分溶解，定容至1000mlA.82.5mmol/LMgCl