DB21T 2251-2014 豬流行性腹瀉病毒RT-PCR檢測(cè)方法　

ICS11.220B41DB21DB21/T2251—2014豬流行性腹瀉病毒RT-PCR檢測(cè)方法MethodofRT-PCRforthedetectionofporcineepidemicdiarrheavirus遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDB21/T2251—2014本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提出。本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省畜牧獸醫(yī)局歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、遼寧省動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究院。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：于學(xué)武顧貴波陳瑤趙曉彤趙鳳菊劉坤洋關(guān)乃鵬王珊珊刁賀軍王冰鄧文超1DB21/T2251—2014本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬流行性腹瀉病毒（porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）RT-PCR檢測(cè)方法的儀器和器材、試劑和材料、操作步驟和結(jié)果判定，并介紹了其原理。本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬流行性腹瀉的診斷和監(jiān)測(cè)，適用于豬腸內(nèi)容物、糞便以及細(xì)胞培養(yǎng)物中PEDV核酸2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第302號(hào)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全技術(shù)管理規(guī)范3縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本標(biāo)準(zhǔn)。PEDV：豬流行性腹瀉病毒（porcineepidemicdiarrheavirus）DEPC：焦炭酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）BP：堿基對(duì)（basepair）RT-PCR：反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reversetranscriptionpolymerasechainreaction）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）4原理PEDV是一種RNA病毒。RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA可作為PCR模板進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)PEDV保守基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以引物為延伸起點(diǎn)，通過(guò)變性、退火和延伸，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA。5儀器和器材本技術(shù)規(guī)范中需使用的主要儀器和器材有高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（最大離心力12000g以上）、冰箱（2~8℃,-20℃和-70℃三種）、PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、微波爐、分析天平、1.5mL離心管、0.2mL離心管、微量移液器和吸頭。6試劑和材料2DB21/T2251—20146.1Trizol：RNA抽提試劑，外觀為粉紅色，分裝至棕色瓶中，于4～8℃保存。6.2氯仿：4℃預(yù)冷。6.3異丙醇：4℃預(yù)冷。6.475%乙醇：用新開(kāi)啟的無(wú)水乙醇和DEPC水配制，-20℃預(yù)冷。6.5DEPC水：去離子水中加入0.1%DEPC，37℃作用1h，121（士2）℃,高壓滅菌15min。6.6RNA酶抑制劑（40U/μL）。6.7DNA聚合酶：HSTaqDNA聚合酶（5U/μL）。6.8dNTP(2.5mmol/L)。6.9用于RT-PCR反應(yīng)的引物濃度為20μmol/L，其序列如下：上游引物F：5′-TTCCCAGCGTAGTTGAGATTG-3′下游引物R：5′-CGAAGTGGCTCTGGATTTGTT-3′6.10反轉(zhuǎn)錄酶：AMV反轉(zhuǎn)錄酶（5U/μL）。6.11反轉(zhuǎn)錄引物：OligodT-AdaptorPrimer（2.5μmol/L）。6.12陰性對(duì)照：DEPC水。6.13陽(yáng)性對(duì)照：PEDV細(xì)胞培養(yǎng)物。6.14PBS：磷酸鹽緩沖液（0.02mol/LpH7.2）。6.15TAE：三羥甲基氨基甲烷一乙酸電泳緩沖液。6.16溴化乙錠。6.17DL2000DNAMarker。注：除另有說(shuō)明，所用試劑均為分析純；所有試劑均用無(wú)RNA酶的容器分裝。7操作步驟7.1樣品的采集、前處理、存放和運(yùn)送7.1.1采樣注意事項(xiàng)采樣及樣品前處理過(guò)程中應(yīng)戴一次性手套，樣本間不得交叉污染。7.1.2采樣工具藥匙、15mL離心管和1.5mL離心管經(jīng)121（士2）℃高壓滅菌15min；剪刀、鑷子經(jīng)160℃干烤2h。7.1.3腸內(nèi)容物的采集與前處理3DB21/T2251—2014采取病死或剖殺豬的小腸內(nèi)容物，裝入15mL滅菌離心管中，按1：5倍體積加入PBS（見(jiàn)附錄A混勻，3000rpm離心20min，取上清液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中編號(hào)備用，待檢。7.1.4糞便的采集與前處理用藥匙采取發(fā)病豬新鮮糞便，裝入15mL滅菌離心管中，按1：5倍體積加入PBS（見(jiàn)附錄A混勻，3000rpm離心20min，取上清液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中編號(hào)備用，待檢。7.1.5細(xì)胞培養(yǎng)物細(xì)胞培養(yǎng)物凍融3次，轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中編號(hào)備用。7.1.6存放與運(yùn)送采集或處理的樣品在2~8℃條件下保存應(yīng)不超過(guò)24h；若需長(zhǎng)期保存，應(yīng)放置-70℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（凍融不超過(guò)3次）。采集的樣品密封后，采用保溫壺或保溫桶加冰密封，在6~8h之內(nèi)運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。按照《獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全技術(shù)管理規(guī)范》進(jìn)行樣品的生物安全標(biāo)識(shí)。7.2RT-PCR檢測(cè)7.2.1RNA提取在核酸提取室進(jìn)行。7.2.1.1取n個(gè)滅菌的1.5mL離心管，其中n為待檢樣品數(shù)+陽(yáng)性對(duì)照管數(shù)+陰性對(duì)照管數(shù)，對(duì)每個(gè)離心管進(jìn)行編號(hào)。7.2.1.2每管加入750μLTrizol，分別加入被檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照各250uL，顛倒10次混勻，室溫靜置5min；再加入250μL氯仿，混勻器上振蕩混勻15s（也可以用手反復(fù)顛倒混勻）。4℃12000g離心15min。7.2.1.3取與7.1.1中相同數(shù)量滅菌的1.5mL離心管，加入500μL異丙醇(4℃預(yù)冷)。取7.1.2中離心后的上清液約500μL轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，顛倒混勻，室溫靜置15min。7.2.1.44℃12000g離心15min，棄上清，倒置于吸水紙上，沾干液體，加入1mL75%乙醇，顛倒洗滌。7.2.1.54℃12000g離心10min，棄上清，倒置于吸水紙上，沾干液體。7.2.1.64000g離心10s，用微量加樣器小心將殘余液體吸干，室溫干燥3~10min。7.2.1.7加入20μL經(jīng)DEPC處理的水和2μLRNA酶抑制劑，輕柔混勻，溶解管壁上的RNA，冰上保存?zhèn)溆?。提取的RNA應(yīng)在2h內(nèi)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；于-70℃冰箱長(zhǎng)期保存。7.2.2反轉(zhuǎn)錄7.2.2.1反轉(zhuǎn)錄體系建立10μL的反應(yīng)體系，按下列組分加入離心管中：MgCl22μL10×RTBufferRNaseFreedH2O3.75μL4DB21/T2251—2014dNTPMixture(各10mM)1μLRNaseInhibitor0.25μLAMVReverseTranscriptase*10.5μLOligodT-AdaptorPrimer0.5μL實(shí)驗(yàn)樣品RNA1μL7.2.2.2反轉(zhuǎn)錄條件7.2.3PCR7.2.3.1PCR反應(yīng)體系建立50μL的反應(yīng)體系，按下列組分加入PCR專(zhuān)用離心管中：5×PCRBuffer滅菌蒸餾水28.75μLHSTaqDNA聚合酶0.25μL上游特異性PCR引物0.5μL下游特異性PCR引物0.5μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物7.2.3.2PCR反應(yīng)條件7.2.3.3電泳將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6μL與1μL上樣緩沖液混合，點(diǎn)樣于1.2%瓊脂糖凝膠（見(jiàn)附錄A）板加樣孔中，瓊脂糖凝膠板一側(cè)點(diǎn)樣孔加入DL2000DNAMarker（分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物緩沖液為1×TAE，以5V/cm電壓電泳25min。8結(jié)果判定紫外凝膠成像儀下觀察結(jié)果，當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)在428bp擴(kuò)增條帶，陰性對(duì)照未出現(xiàn)目的條帶時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可作為判定依據(jù)。被檢樣品出現(xiàn)428bp擴(kuò)增條帶為PEDV陽(yáng)性，未出現(xiàn)428bp擴(kuò)增條帶的樣品判為陰性。56DB21/T2251—2014（規(guī)范性附錄）A.10.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)的配制A.1.10.2mol/L磷酸氫二鈉溶液：稱(chēng)取磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H20)71.64g，先加適量去離子水溶解，最后定容至1000mL，混勻。A.1.20.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：稱(chēng)取磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H20)31.21g，先加適量去離子水溶解，最后定容至1000mL，混勻。A.1.3量取0.2moL/L磷酸氫二鈉溶液360mL，0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液140mL，稱(chēng)取氯化鈉38g，用無(wú)離子水溶解稀釋至5000mL，4℃保存。A.2電泳緩沖液(50倍)A.2.10.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉(EDTA)溶液(pH8.0)二水乙二銨四乙酸二鈉(分析純)滅菌雙蒸水80mL氫氧化鈉調(diào)pH至8.0滅菌雙蒸水加至100mLA.2.2TAE(三羥甲基氨基甲烷一乙酸)電泳緩沖液(50倍)羥基甲基氨基甲烷(Tris)（分析純)242g冰乙酸57.1mL0.5mol/L乙二銨四乙酸