DB21T 2339-2014 百合鱗片組織培養(yǎng)擴(kuò)繁技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.01DB21DB21/T2339—2014百合鱗片組織培養(yǎng)擴(kuò)繁技術(shù)規(guī)程遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDB21/T2339—2014本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009規(guī)則編寫(xiě)。本標(biāo)準(zhǔn)由沈陽(yáng)市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：沈陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院、鐵嶺市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：李明艷、遲東明、左麗君、岳玲、宋偉、果朋忠、馬東梅、李金鳳、張家旺、徐丹、姚斌。1DB21/T2339—2014本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了遼寧省百合鱗片組培生產(chǎn)環(huán)境的消毒滅菌、培養(yǎng)條件調(diào)控以及組培苗接種、繼代、生根、移栽等的技術(shù)操作程序，并對(duì)其生產(chǎn)、試驗(yàn)設(shè)備、設(shè)施提出了具體要求本標(biāo)準(zhǔn)適用于遼寧省百合組培苗工廠化生產(chǎn)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T603化學(xué)試劑試驗(yàn)方法中所用制劑及制品的制備GB4285-89農(nóng)藥安全使用標(biāo)準(zhǔn)GB/T8321（所有部分）農(nóng)藥合理使用準(zhǔn)則NY/T2306-2013花卉種苗組培快繁技術(shù)規(guī)程下列定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1植物組織培養(yǎng)從植物體分離出符合需要的器官、組織或細(xì)胞、原生質(zhì)體等，通過(guò)無(wú)菌操作，在人工控制條件下進(jìn)行培養(yǎng)以獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的其他產(chǎn)品的技術(shù)。3.2植體由活植物體上切取下來(lái)以進(jìn)行培養(yǎng)的器官、組織或細(xì)胞、原生質(zhì)體。3.3培養(yǎng)基供植物外植體存活和生長(zhǎng)所必需的介質(zhì)，通常由水、無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)物質(zhì)、凝固劑、糖以及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)等組成。3.4初代培養(yǎng)2DB21/T2339—2014接種外植體后繼代培養(yǎng)之前的培養(yǎng)。3.5繼代培養(yǎng)對(duì)來(lái)自于初代培養(yǎng)獲得的芽、原球莖等，通過(guò)分離切割并更新培養(yǎng)基，使培養(yǎng)材料數(shù)量上增加，并得到無(wú)根的幼苗。3.6生根培養(yǎng)把無(wú)根的幼苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，培養(yǎng)成生根苗的過(guò)程。3.7煉苗在保護(hù)設(shè)施中，采取逐步通風(fēng)、控溫、遮光等措施，使幼苗適應(yīng)外界環(huán)境的過(guò)程。4生產(chǎn)設(shè)備（施）及化學(xué)試劑4.1建筑設(shè)施設(shè)計(jì)組培實(shí)驗(yàn)室或小型組培工廠必須選擇環(huán)境優(yōu)靜、無(wú)污染的地方并保證其生產(chǎn)過(guò)程中不對(duì)周?chē)h(huán)境造成污染。實(shí)驗(yàn)室或小型組培工廠各部分的配置要合理，做到工作方便、使用安全、節(jié)省能源。房屋設(shè)計(jì)包括準(zhǔn)備室、接種室、培養(yǎng)室、洗滌室、實(shí)驗(yàn)室、貯存室、溫室，另外還可配置辦公室、更衣室等。4.2洗滌設(shè)備工廠化生產(chǎn)可選用自動(dòng)或半自動(dòng)洗瓶機(jī)，實(shí)驗(yàn)室或小型車(chē)間選用普通洗滌用具，如洗滌室水槽、塑料盆、塑料桶、塑料箱等，人工洗滌。另外配置干燥箱、晾瓶架等。4.3滅菌設(shè)備高壓蒸汽滅菌鍋（大型臥式、中型立式、小型手提式、器械消毒器、紫外燈、烘干箱、微濾孔器4.4滅菌劑選用酒精、氯化汞、次氯酸鈉、高錳酸鉀、甲醛、過(guò)氧乙酸、新潔爾滅、來(lái)蘇水、抗菌素等。5組培室消毒滅菌洗滌室每天用來(lái)蘇水、過(guò)氧乙酸等噴灑地面，保持室內(nèi)清潔。接種室接種前用紫外燈照射20min-30min，并定期(一般7d)用高錳酸鉀及甲醛混合薰蒸。培養(yǎng)室的消毒滅菌一般7d左右用高錳酸鉀3DB21/T2339—2014及甲醛混合薰蒸，或用70％酒精噴霧消毒，也可選用廣普性殺菌煙霧劑薰蒸。超凈工作臺(tái)接種前用紫外燈照射20min-30min，并用70％酒精噴灑臺(tái)面，或用新潔爾滅擦拭臺(tái)面；定期清洗超凈工作臺(tái)過(guò)濾膜以保證過(guò)濾膜清潔。培養(yǎng)基的消毒滅菌高溫高壓蒸汽消毒，通常在壓力1.1kg/cm2、溫度121℃條件下保持，污染的瓶苗消毒滅菌用消毒鍋高溫高壓消毒，然后再清洗培養(yǎng)容器。6初代培養(yǎng)由于百合鱗莖材料生長(zhǎng)在土中，受土壤微生物的影響，污染率相當(dāng)高，為此外植體消毒要嚴(yán)加注意。所以應(yīng)取鱗莖由外向內(nèi)的第2-5層鱗片，流水沖洗30分鐘后用0.2%-0.5%的洗衣粉水浸10min，在自來(lái)水下沖洗干凈。然后用75%酒精滅菌30s，再用0.1%的升汞溶液浸泡8min，期間不斷進(jìn)行搖動(dòng)，最后用無(wú)菌水沖洗5-6次。沿鱗片周?chē)腥?mm，然后選取外層下部與鱗莖盤(pán)相連的部分為最佳外植體橫切約為1.0cm的小塊。將消毒后的無(wú)菌鱗片小塊接種到MS+2.0mg/LBA+0.2mg/LNAA培養(yǎng)基中，置于25±2℃,照光9-10h，光強(qiáng)1200lx條件下培養(yǎng)。接種2周里，即有98%左右的鱗片切塊在近軸或邊緣上誘導(dǎo)，也會(huì)有淡黃色的不定芽原基呈環(huán)狀突起，這些不定芽在4周以后，可形成中間軸出小鱗莖，在小鱗莖基部發(fā)生一些粗壯的根。將幼苗切成1.5-2cm長(zhǎng)的片段，接種到誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基上。3周后葉子的基部、葉脈、葉緣上均可誘導(dǎo)出一團(tuán)團(tuán)淡黃色的愈傷組織。7繼代培養(yǎng)分化培養(yǎng)時(shí)，可用MS+0.5mg/LBA+0.05mg/LNAA培養(yǎng)基。將愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，10周后，愈傷組織逐漸膨大，分化出許多大小不等的鱗莖。將小鱗莖分離出來(lái)以后，留下愈傷組織轉(zhuǎn)移到相同的新鮮分化培養(yǎng)基中，一段時(shí)間后仍能分化出小鱗莖。8生根培養(yǎng)將繼代培養(yǎng)基中長(zhǎng)勢(shì)較好的百合鱗莖和鱗莖切塊(縱切4塊)接種到1/2MS+0.4mg/LNAA+1.0g/LAC的生根培養(yǎng)基中。9煉苗移栽9.1溫室消毒移栽前半個(gè)月，用1%的甲醛溶液對(duì)溫室進(jìn)行熏蒸消毒；用石灰水或高錳酸鉀溶液對(duì)地面消毒；用高錳酸鉀溶液對(duì)工具浸泡消毒。9.2煉苗長(zhǎng)出2-3片葉子的生根苗即可進(jìn)行煉苗。先將生根苗連同容器一起置于移栽設(shè)施中，放置1周，然后打開(kāi)瓶口再放置2d-3d。9.3移栽移栽前將組培苗先用1000倍的多菌靈或百菌清浸泡24h，使其充分吸收水分，然后用脫水機(jī)將其脫水至手握無(wú)水下滴即可用于移栽。移栽時(shí)小心取出生根苗，用清水洗去根部粘附的培養(yǎng)基,將幼苗根4DB21/T2339—2014在室溫下不打開(kāi)瓶蓋，自然光照下練苗一周后,打開(kāi)瓶蓋練苗2-3d后移栽。練苗合理程度應(yīng)使原有葉片緩慢衰退,新葉逐漸產(chǎn)生。如降低濕度過(guò)快、光線增加過(guò)大，原有葉衰退過(guò)速，則使得根系萎縮，原有葉片褪綠和灼傷、死亡或緩苗過(guò)長(zhǎng)而不能成活。9.4環(huán)境要求空氣濕度保持在80%-90%，遮