DB21T 2357-2014 A型口蹄疫病毒核酸RT-PCR檢測方法　

ICS11.220B41DB21DB21/T2357—2014A型口蹄疫病毒核酸RT-PCR檢測方法RT-PCRassayforFoot-and-mouthdiseasevirusserotypeAnucleicacid遼寧省質量技術監(jiān)督局發(fā)布IDB21/T2357—2014本標準按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標準由遼寧省動物疫病預防控制中心提出。本標準由遼寧省畜牧獸醫(yī)局歸口。本標準起草單位：遼寧省動物疫病預防控制中心、遼寧省動物醫(yī)學研究院。本標準主要起草人：顧貴波、王宏燕、曹東、薛樹山、楊作豐、石霖、楊本勇、李紅魁、王克才、吳運譜、鄭洪玲、閆海濱、馬永春、王國慶1DB21/T2357—2014本標準規(guī)定了A型口蹄疫病毒（FMDV-A）RT-PCR檢測方法的技術要求。本標準規(guī)定的RT-PCR方法適用于檢測偶蹄動物的水皰皮、水皰液、淋巴結、脊髓等組織樣品及食道-咽部分泌物（O-P液）。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法口蹄疫診斷技術規(guī)范獸醫(yī)實驗室生物安全技術管理規(guī)范3縮略語下列縮略語適用于本標準。FMDV-A（Foot-and-mouthdiseasevirusserotypeA）A型口蹄疫O-P（Oesophagus-pharyngeal）食道-咽部分泌物DEPC（Diethypyrocarbonate）焦炭酸二乙酯EDTA（EthyleneDiamineTetraaceticAcid）乙二胺四乙酸dNTP(deoxy-ribonucleosidetriphosphate)脫氧核苷酸三磷酸EB（Ethidiumbromide）溴化乙錠TAE（Tris/Acetate/EDTA）TAE緩沖液PBS（PhosphateBufferedSaline）磷酸鹽緩沖液RNA(Ribonucleicacid)核糖核酸DNA（Deoxyribonucleicacid）脫氧核糖核酸cDNA（complementarydeoxyribonucleicacid）互補脫氧核糖核酸RT-PCR（Reverse-transcriptionpolymerasechainreaction）反轉錄-聚合酶鏈式反應PCR（PolymeraseChainReaction）聚合酶鏈式反應TaqDNApolymeraseTaqDNA聚合酶4原理FMDV是一種RNA病毒。RNA反轉錄產生的cDNA可作為PCR模板進行擴增。根據FMDV-A保守基因序列設計一對引物，在TaqDNApolymerase催化下，以母鏈DNA為模板，以引物為延伸起點，通過變性、退火和延伸，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA。2DB21/T2357—20145實驗器材眼科剪、眼科鑷、1.5mL滅菌離心管（經DEPC水處理）、0.2mL薄壁PCR管、500mL量筒、500mL三角瓶、吸頭、分析天平、臺式低溫高速離心機、PCR儀、電泳儀、電泳槽、凝膠成像儀、冰箱、微波爐、組織研磨器、微量移液器。6試劑6.1TRIzolRNA提取試劑或其他商品化的RNA提取試劑。6.2氯仿、異丙醇、無水乙醇。6.31%瓊脂糖凝膠（見附錄A中A.1）。6.4溴化乙錠（EB，10μg/μL）溶液（見附錄A中A.2）。6.550×TAE電泳緩沖液（見附錄A中A.3）。6.6焦炭酸二乙酯（DEPC）處理的滅菌雙蒸水（DEPC水見附錄A中A.4）。6.7DNA分子量標準(DL2000Marker)。6.875%乙醇（用DEPC水配制見附錄A中A.5）。6.9上樣緩沖液。6.11磷酸鹽緩沖液（PBS0.01mol/L、pH7.2見附錄A中A.6）。6.1250%甘油磷酸鹽緩沖液（見附錄A中A.7）。6.13商品化的一步法或兩步法RT-PCR反應試劑。含有：10U/μLAMV反轉錄酶、50U/μLRNA酶dNTP混合物、10×RT緩沖液、10×PCR緩沖液、25mmol/L氯化鎂（MgCL）和無RNA酶的水。注：除另有規(guī)定，所用試劑均為分析純，水為符合GB/T6682-2008的滅菌雙蒸水或超純水。7.1上游引物：5′-CTTGCACTCCCTTACACCGCG-3′，引物濃度10pm/μL。7.2下游引物：5′-CATGTCCTCTTGCATCTGGTT-3′，引物濃度10pm/μL。8樣品對照以滅活的A型口蹄疫病毒細胞培養(yǎng)液作為陽性對照，以滅菌雙蒸水作為陰性對照。9操作步驟3DB21/T2357—20149.1樣品的采集、保存運送和處理9.1.1采樣工具采樣工具（剪刀、鑷子、滅菌小瓶、探杯）應經121℃±2℃,15min高壓滅菌并烘干。9.1.2組織樣品的采集和保存9.1.2.1樣品采集部位可用清水（切忌使用酒精、碘酒等消毒劑消毒、擦拭），剪取病畜的新鮮水皰皮3～5g放入滅菌小瓶中，加入適量50%甘油磷酸鹽緩沖液（pH7.2），加蓋密封；也可采用無菌器具采集水皰液，裝入滅菌小瓶中（可加適量抗菌素），加蓋密封，冷凍保存。9.1.2.2在無法采集水皰皮和水皰液時，可采集淋巴結、脊髓等組織樣品，裝入滅菌小瓶內，加蓋密封，冷凍保存。9.1.3食道-咽部分泌物（O-P液）的采集和保存采樣探杯在使用前經0.2%檸檬酸或2%氫氧化鈉浸泡5min，再用潔凈水沖洗。每采完一頭動物，探杯要進行消毒并充分清洗。采樣時動物站立保定，將探杯隨吞咽動作送入食道上部10～15cm處，輕輕來回移動2～3次，然后將探杯拉出。將采集到的8～10mLO-P液倒入滅菌容器中，容器中應事先加有8～10mL磷酸鹽緩沖液（0.01mol/L、pH7.2），密封后充分搖勻，冷凍保存。9.1.4樣品運送運輸時樣品容器與采樣記錄一同裝入專用運輸容器中。專用運輸容器應隔熱堅固，內裝適當冷凍劑和防震材料。外包裝上要加貼生物安全警示標志。9.1.5樣品處理9.1.5.1水皰液、O-P液：不需處理，可以直接進行核酸提取。9.1.5.2水皰皮、淋巴結等組織樣品：取樣品2.0g（淋巴結、肌肉等組織樣品去除包膜及其他結締組織）于潔凈、滅菌并烘干的研缽中，加入等量滅菌石英砂充分研磨，加10mL磷酸鹽緩沖液(0.01mol/L、pH7.2)混勻制成1:5懸液，4℃浸泡過夜或者-20℃反復凍融2次，每次30min，然后4℃3000rpm離心15min，取上清液轉入無菌的1.5mL離心管中，編號備用。9.2RNA的提取9.2.1用TRIzolRNA試劑提取待檢樣品、陽性對照及陰性對照樣品的RNA。9.2.2250μL樣品處理液和750μLTRIzol置于一個1.5mL離心管中，振蕩數次，靜置5min。9.2.3加入250μL氯仿，振蕩混勻，室溫放置5min，4℃12000rpm，離心15min。9.2.4吸取上層水相到一新的離心管中，加入等量異丙醇，混勻，室溫放置15min，4℃12000rpm，離心15min，棄去上清。9.2.5小心吸棄上清，加入1mL75%乙醇（DEPC水配制小心顛倒以漂洗沉淀及管壁，4℃12000rpm，離心15min。9.2.6小心吸棄上清，沉淀置室溫條件下干燥后，加適量DEPC水溶解。9.2.7提取的RNA須在2h內進行RT-PCR擴增，若需長期保存，須放置-70℃冰箱保存。4DB21/T2357—20149.3RT-PCR9.3.1一步法反應操作步驟9.3.1.1在0.2mL反應管中依次加入（RT-PCR反應體系為25μL無RNA酶的水14.5μL5×RT-PCR緩沖液5μLdNTP0.5μL25mmol/LMgSO41μL上游引物（10pm/μL）1μL下游引物（10pm/μL）1μLRNA模板1μLAMV反轉錄酶0.5μLTaqDNApolymerase0.5μL9.3.1.2用PCR儀立即進行RT-PCR擴增，同時設立陰、陽性對照。9.3.2兩步法反應操作步驟9.3.2.1在0.2mL反應管中依次加入（RT反應體系10μL無RNA酶的水3.25μL10×RT緩沖液25mmol/LMgCL2dNTP下游引物（10pm/μL）RNA模板RNA酶抑制劑0.25μLAMV反轉錄酶0.5μL42℃水浴30min，合成cDNA。取出直接進行PCR或-20℃保存。9.3.2.2PCR體系（50μL）包括：滅菌雙蒸水28.75μL5×PCR緩沖液上游引物（10pm/μL）cDNATaqDNApolymerase0.25μL首先加入滅菌雙蒸水，然后再按照順序逐一加入上述成分，每一次要加到液面下。全部加完后，混勻，瞬時離心，使液體全部沉降到PCR管底。9.4擴增產物的電泳檢測5制備1%濃度的瓊脂糖凝膠板，在電泳槽中加入1×TAE電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠。取3~恒壓(110V)下電泳20～25min,將電泳好的凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)上觀察結果。95試驗成立的條件96結果判定6DB21/T2357—2014A.11%瓊脂糖凝膠瓊脂糖（電泳級）1×TAE電泳緩沖液微波爐中完全融化，溫度降至60mm。A.21%溴化乙錠（EB）溶液溴化乙錠滅菌雙蒸水A.350×TAE電泳緩沖液（規(guī)范性附錄）加至100mL℃左右時，加入5μL溴化乙錠（EB）溶液，均勻鋪板，厚度3～50.2g加至20mLA.3.10.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉（EDTA）溶液（pH8.0）二水乙二銨四乙酸二鈉滅菌雙蒸水80mL氫氧化鈉調pH至8.0滅菌雙蒸水加至100mLA.3.2TAE(三羥甲基氨基甲烷－乙酸)電泳緩沖液（50×)羥基甲基氨基甲烷（Tris）242g冰乙酸57.1mL0.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉（EDTA）溶液（pH8.0）100mL滅菌雙蒸水加至1000mL用時用滅菌雙蒸水稀釋使用。A.4DEPC水雙蒸水100mLDEPC100μL室溫過夜，121℃高壓滅菌15min，分裝到1.5mLDEPC處理過的離心管。A.575%乙醇（DEPC水配制）無水乙醇（分析純）75mL7DB21/T2