超詳細TUNEL凋亡檢測Protocol

一、實驗原理細胞凋亡時，染色體DNA斷裂會產生大量的粘性3'-OH末端，經(jīng)過固定與破膜后，這些暴露的3'-OH能夠在TdT（脫氧核糖核酸末端轉移酶）的催化下與帶有熒光素標記的dUTP連接，形成衍生物標記到DNA的3'-末端?？梢酝ㄟ^熒光顯微鏡檢測熒光強度，來準確地反映出凋亡細胞。二、自備試劑細胞樣本＞固定液(4%多聚甲醛溶于PBS)。通透液(0.2%的Triton-100溶于PBS)。石蠟切片＞二甲苯、乙醇。冰凍切片＞固定液(4%多聚甲醛溶于PBS)。其他試劑＞PBS、ddH2O、抗熒光淬滅劑的封片液。三、試劑盒組分與儲存一步法TUNEL原位細胞凋亡檢測試劑盒（綠色，SUNNCELL?488）-20°C保存。熒光標記液需避光保存。熒光標記液和TdT酶避免反復凍融，使用前離心渦旋混勻。四、試劑配制★1×蛋白酶K工作液：取1μLProteinaseK(100×)加入99μLPBS中，混勻?，F(xiàn)配現(xiàn)用?！?×DNaseIBuffer工作液：按照9:1的比例用ddH2O將DNaseIBuffer(10×)稀釋待用。現(xiàn)配現(xiàn)用。★

DNaseI工作液（200U/mL）：用1×DNaseIBuffer工作液，按照99：1稀釋比將DNaseI(20U/μL)稀釋待用?，F(xiàn)配現(xiàn)用。注：DNaseI會在劇烈混合下變性，建議不要渦旋DNaseI溶液。★DAPI工作液：取4μLDAPIReagent(25μg/mL)加入96μLPBS中混勻?，F(xiàn)配現(xiàn)用。五、固定與通透1.細胞樣本1）細胞爬片：將細胞爬片浸入PBS漂洗1次，濾紙吸干周圍水分，再浸入固定液（自備），室溫固定15~20min或4°C固定1~2h。細胞涂片：收集細胞，加入一定體積的PBS重懸細胞沉淀，然后加入和PBS等體積的固定液（自備），室溫固定15~20min或4°C固定1~2h。600×g離心5min，PBS重懸，取25~50μL細胞懸液涂片在載玻片上晾干。2）固定好的樣本浸入PBS漂洗3次，每次5min。3）將樣本浸入通透液（自備）中，37°C作用10min。4）將通透好的樣本浸入PBS漂洗3次，每次5min。2.石蠟切片1）用常規(guī)方法將切片脫蠟水化。將切片浸入二甲苯（自備），脫蠟2次，每次10min；無水乙醇（自備）浸泡切片2次，每次5min；90%、80%、70%的乙醇水溶液（自備）各一次，每次3min。2）脫蠟好的樣本浸入PBS漂洗3次，每次5min。3）濾紙吸干切片組織周圍的水分，每個樣本上滴加100μL1×蛋白酶K工作液，37°C反應20min。注：不同組織或物種的樣本反應時間可能不同。建議進行預實驗，確定反應時間。4）將通透好的樣本浸入PBS漂洗3次，每次5min。3.冰凍切片1）取出冰凍切片，平衡至室溫，再浸入固定液（自備），室溫（15~25°C）固定30min。2）固定好的樣本浸入PBS漂洗2次，每次5min。3）每個樣本上滴加100μL1×蛋白酶K工作液，37°C反應10~20min。注：不同組織或物種的樣本反應時間可能不同。建議進行預實驗，確定反應時間。4）將通透好的樣本浸入PBS漂洗3次，每次5min。六、試劑配制1.分組設置★

陽性對照1)滴加100μL1×DNaseIBuffer工作液到已通透的樣本上，室溫平衡5min。2)用吸水紙去除樣本上多余的液體。加入100μL稀釋后的DNaseI工作液（200U/mL)，37°C孵育10~30min。★陰性對照1)滴加100μL1×DNaseIBuffer工作液到已通透的樣本上,室溫平衡5min。2)DNaseIBuffer孵育陰性樣本，37°C孵育10~30min。3)樣本浸入PBS漂洗3次，每次5min?！飳嶒灲M實驗組通透完成后在PBS中靜置，等待陽性對照和陰性對照處理后共同進行標記染色。2.標記工作液的配制算好樣本量集中配制，每個樣本用量按照下表配制，充分混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。注：a)TdTEquilibrationBuffer使用前，室溫靜置直至完全溶解。冰凍的平衡液融化后可能會出現(xiàn)鈷鹽結晶，此為正?，F(xiàn)象，可在使用前渦旋混勻。b)LabelingSolution使用前，請置于冰上溶解，待完全溶解后離心，并用槍頭吹打混勻。c)TdTEnzyme對溫度較敏感，請嚴格保存于-20°C，使用前取出，使用后立即放回。d)

配制標記工作液時，建議不要渦旋。50μL標記工作液可覆蓋的樣本面積約為5cm2，對于表面積更大的樣本可以成比例的增加工作液體積。3.標記步驟1)每個樣本滴加100μLTdTEquilibrationBuffer，37°C濕盒中平衡10~30min。2)吸水紙吸除TdTEquilibrationBuffer（注意不要干片)，每個樣本滴加50μL標記工作液，放入濕盒中37°C避光反應60min。注：如果信號強度較弱，則可延長DNA標記反應的培養(yǎng)時間。某些系統(tǒng)可能需要在37°C下反應4小時。3)樣本浸入PBS漂洗3次，每次5min。4)吸水紙吸干水分后滴加DAPI工作液，室溫避光孵育5min，對細胞核進行復染。5)樣本浸入PBS漂洗4次，每次5min。6)用吸水紙吸干多余的液體，用含抗熒光淬滅劑（自備）的封片劑封片。檢測在熒光顯微鏡下選擇合適的濾光片觀察結果。注：熒光易淬滅，請盡快觀察拍照。若無法立即觀察，請于4°C避光保存。七、實驗結果展示Positivegroup：Hela細胞接種細胞爬片，固定通透，經(jīng)DNaseI工作液37°孵育10min。Negativegroup：Hela細胞接種細胞爬片，固定通透，經(jīng)DNaseIBuffer孵育，不加TdTEnzyme495nm激發(fā)光519nm發(fā)射波長濾光片或者FITC通道檢測，倒置熒光顯微鏡拍照觀察。八、注意事項PBS清洗樣本后，請盡量除去PBS溶液后再進行下一步操作。實驗過程中請保持樣本的濕潤，防止干片造成的實驗失敗。TdT酶工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，短暫于冰上保存，長期保存會導致酶失活影響實驗結果。為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。本說明書中推薦的條件是通用的，用戶可根據(jù)不同的樣本類型和預實驗的結果，對樣本處理時間、試劑濃度等條件進行優(yōu)化，選擇最合適的實驗條件。本產品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。九、FAQs問：TUNEL檢測試劑盒可以同時檢測多個不同種屬的樣本嗎？答：可以檢測，從其原理來說，是不分種屬的。

問：陽性對照組的熒光強度比較低可能是什么原因？答：可能的原因有：1)操作過程中試劑添加有遺漏；2）通透效果不好，3）DNaseI工作液的濃度過低。

問：試劑盒中蛋白酶K和DNaseI的