DNA雜交技術(shù)及應(yīng)用

DNA雜交技術(shù)及應(yīng)用摘要：主要介紹DNA雜交技術(shù)的原理，在分開簡單介紹Southern雜交、Northern雜交的技術(shù)原理和主要的技術(shù)過程。最后簡單的舉例他們?cè)趯?shí)踐中的運(yùn)用。關(guān)鍵詞：Southern雜交Northern雜交雜交技術(shù)應(yīng)用Abstract:IntroducestheprincipleofDNAhybridizationtechnique,andSeparateintroducetheprincipleandthemaintechnicalprocessofsouthernblottechnique,northernblottec-htechnique.Atlastusesomeexampletoshowtheiruseinpractice.Keywords:southernblottechniquenorthernblottechniqueuseofhybridizationtechnique互補(bǔ)的核苷酸序列通過Walson-Crick堿基配對(duì)形成穩(wěn)定的雜合雙鏈分子DNA分子的過程稱為雜交。是指把不同來源的DNA分別加熱100℃或調(diào)節(jié)pH到大于13時(shí)，DNA會(huì)變性解離成單鏈,再把兩種來源的DNA單鏈放到一起，在60℃保持相當(dāng)長時(shí)間,互補(bǔ)的DNA單鏈就會(huì)重新形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，我們把它叫雜合雙鏈，這即是兩個(gè)DNA具有相同堿基對(duì)排列順序的部分。雜交過程是高度特異性的,可以根據(jù)所使用的探針已知序列進(jìn)行特異性的靶序列檢測[1]。1.1Southern雜交該法是將DNA片段電泳后，從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜(NCM)或尼龍膜上，然后與探針雜交。被檢測對(duì)象為DNA，探針為DNA或RNASouthern印跡雜交是進(jìn)行基因組DNA特定序列定位的通用方法。一般利用瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNA片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照射固定，再與相對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，用放射自顯影或酶反應(yīng)顯色，從而檢測特定DNA分子的含量[2]。Southern印跡雜交技術(shù)是分子生物學(xué)領(lǐng)域中最常用的具體方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下，可按堿基互補(bǔ)的原則形成雙鏈，此雜交過程是高度特異的。由于核酸分子的高度特異性及檢測方法的靈敏性，綜合凝膠電泳和核酸內(nèi)切限制酶分析的結(jié)果，便可繪制出DNA分子的限制圖譜。但為了進(jìn)一步構(gòu)建出DNA分子的遺傳圖，或進(jìn)行目的基因序列的測定以滿足基因克隆的特殊要求，還必須掌握DNA分子中基因編碼區(qū)的大小和位置。有關(guān)這類數(shù)據(jù)資料可應(yīng)用Southern印跡雜交技術(shù)獲得。Southern印跡雜交技術(shù)包括兩個(gè)主要過程：一是將待測定核酸分子通過一定的方法轉(zhuǎn)移并結(jié)合到一定的固相支持物（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，即印跡（blotting）；二是固定于膜上的核酸同位素標(biāo)記的探針在一定的溫度和離子強(qiáng)度下退火，即分子雜交過程。該技術(shù)是1975年英國愛丁堡大學(xué)的E.M.Southern首創(chuàng)的，Southern印跡雜交故因此而得名。早期的Southern印跡是將凝膠中的DNA變性后，經(jīng)毛細(xì)管的虹吸作用，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。印跡方法如電轉(zhuǎn)法、真空轉(zhuǎn)移法；濾膜發(fā)展了尼龍膜、化學(xué)活化膜（如APT、ABM纖維素膜）等。利用Southern印跡法可進(jìn)行克隆基因的酶切、圖譜分析、基因組中某一基因的定性及定量分析、基因突變分析及限制性片斷長度多態(tài)性分析（RFLP）等。 1.2Northern雜交 該法是將RNA片段電泳后，從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，然后與探針雜交。被檢測對(duì)象為RNA，探針為DNA或RNA。Northern印跡雜交（Northernblot）。這是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。DNA印跡技術(shù)由Southern于1975年創(chuàng)建，稱為Southern印跡技術(shù)，RNA印跡技術(shù)正好與DNA相對(duì)應(yīng)，故被稱為Northern印跡雜交，與此原理相似的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)則被稱為Westernblot。Northern印跡雜交的RNA吸印與Southern印跡雜交的DNA吸印方法類似，只是在上樣前用甲基氫氧化銀、乙二醛或甲醛使RNA變性，而不用NaOH，因?yàn)樗鼤?huì)水解RNA的2'-羥基基團(tuán)。RNA變性后有利于在轉(zhuǎn)印過程中與硝酸纖維素膜結(jié)合，它同樣可在高鹽中進(jìn)行轉(zhuǎn)印，但在烘烤前與膜結(jié)合得并不牢固，所以在轉(zhuǎn)印后用低鹽緩沖液洗脫，否則RNA會(huì)被洗脫。在膠中不能加EB，因?yàn)樗鼤?huì)影響RNA與硝酸纖維素膜的結(jié)合。為測定片段大小，可在同一塊膠上加分子量標(biāo)記物一同電泳，之后將標(biāo)記物切下、上色、照相，樣品膠則進(jìn)行Northern轉(zhuǎn)印。標(biāo)記物膠上色的方法是在暗室中將其浸在含5μg/mlEB的0.1mol/L醋酸銨中10min，光在水中就可脫色，在紫外光下用一次成像相機(jī)拍照時(shí)，上色的RNA膠要盡可能少接觸紫外光，若接觸太多或在白熾燈下暴露過久，會(huì)使RNA信號(hào)降低。瓊脂糖凝膠中分離功能完整的mRNA時(shí)，甲基氫氧化銀是一種強(qiáng)力、可逆變性劑，但是有毒，因而許多人喜用甲醛作為變性劑。所有操作均應(yīng)避免RNase的污染。2.1Southern雜交主要過程1待測核酸樣品的制備（1）制備待測DNA（2）DNA限制酶消化基因組DNA很長，需要將其切割成大小不同的片段之后才能用于雜交分析，通常用限制酶消化DNA2電泳凝膠預(yù)處理a.如果靶序列>5kb，則需進(jìn)行脫嘌呤處理(1)把凝膠浸在0.25mol/LHCl中，室溫輕輕晃動(dòng)，直到溴酚藍(lán)從藍(lán)變黃。注意：處理人類基因組DNA≤10分鐘；處理植物基因組DNA≤20分鐘(2)把凝膠浸在滅菌雙蒸水中b.如果靶序列<5kb，則直接進(jìn)行下面的步驟(1)把凝膠浸在變性液（0.5mol/LNaOH，1.5mol/LNaCl）中，室溫2×15分鐘，輕輕晃動(dòng)(2)把凝膠浸在滅菌雙蒸水中(3)把凝膠浸在中和液中（0.5mol/LTris-HCl，Ph7.5，1.5mol/LNaCl），室溫2×15分鐘(4)在20×SSC中平衡凝膠至少10分鐘3瓊脂糖凝膠電泳分離待測DNA樣品(1)制備瓊脂糖凝膠，盡可能薄。DNA樣品與上樣緩沖液混勻，上樣(2)分子質(zhì)量標(biāo)志物（DIG標(biāo)記）上樣(3)電泳，使DNA條帶很好的分離(4)評(píng)價(jià)靶DNA的質(zhì)量。在電泳結(jié)束后，0.25-0.50μg/mlEB染色15-30min，紫外燈下觀察凝膠4轉(zhuǎn)膜即將凝膠中的單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移到固相支持物上。而此過程最重要的是保持各DNA片段的相對(duì)位置不變。DNA是沿與凝膠平面垂直的方向移出并轉(zhuǎn)移到膜上，因此，凝膠中的DNA片段雖然在堿變性過程已經(jīng)變性成單鏈并已斷裂，轉(zhuǎn)移后各個(gè)DNA片段在膜上的相對(duì)位置與在凝膠中的相對(duì)位置仍然一樣，故而稱為印跡（blotting）。用于轉(zhuǎn)膜的固相支持物有多種，包括硝酸纖維素膜（NC膜）、尼龍（Nylon）膜、化學(xué)活化膜和濾紙等，轉(zhuǎn)膜時(shí)可根據(jù)不同需要選擇不同的固相支持物用于雜交。其中常用的是NC膜和Nylon膜。各種膜的性能和使用情況比較見各種尼龍膜性能及使用情況比較表。探針標(biāo)記用于Southern印跡雜交的探針可以是純化的DNA片段或寡核苷酸片段。探針可以用放射性物質(zhì)標(biāo)記或用地高辛標(biāo)記。6預(yù)雜交（prehybridizafion）7Southern雜交轉(zhuǎn)印后的濾膜在預(yù)雜交液中溫育4-6h，即可加入標(biāo)記的探針DNA（探針DNA預(yù)先經(jīng)加熱變性成為單鏈DAN分子），即可進(jìn)行雜交反應(yīng)。雜交是在相對(duì)高離子強(qiáng)度的緩沖鹽溶液中進(jìn)行。雜交過夜，然后在較高溫度下用鹽溶液洗膜。離子強(qiáng)度越低，溫度越高，雜交的嚴(yán)格程度越高，也就是說，只有探針和待測順序之間有非常高的同源性時(shí)，才能在低鹽高溫的雜交條件下結(jié)合。8洗膜取出NC膜，在2XSSC溶液中漂洗5min，然后按照下列條件洗膜：2×SSC/0.1%SDS，42℃，10min，1S×SCC/0.1%SDS，42℃，10min，0.5S×SCC/0.1%SDS，42℃10min，0.2×SSC/0.1%SDS，56℃，10min，0.1×SSC/0.1%SDS，56℃，10min。采用核素標(biāo)記的探針或發(fā)光劑標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交還需注意的關(guān)鍵一步就是洗膜。在洗膜過程中，要不斷振蕩，不斷用放射性檢測儀探測膜上的放射強(qiáng)度。當(dāng)放射強(qiáng)度指示數(shù)值較環(huán)境背景高1-2倍時(shí)，即停止洗膜。9放射性自顯影檢測（1）將濾膜正面向上，放入暗盒中（加雙側(cè)增感屏）（2）在暗室內(nèi)，將2張X光底片放入曝光暗盒，并用透明膠代固定，合上暗盒（3）將暗盒置-70℃低溫冰箱中使濾膜對(duì)X光底片曝光（根據(jù)信號(hào)強(qiáng)弱決定曝光時(shí)間，一般在1-3天）（4）從冰箱中取出暗盒，置室溫1-2h，使其溫度上升至室溫，然后沖洗X光底片2.2Northern雜交的主要過程 Northern雜交與Southern雜交很相似。主要區(qū)別是被檢測對(duì)象為RNA,其電泳在變性條件下進(jìn)行,以去除RNA中的二級(jí)結(jié)構(gòu),保證RNA完全按分子大小分離。變性電泳主要有3種:乙二醛變性電泳、甲醛變性電泳和羥甲基汞變性電泳。電泳后的瓊脂糖凝膠用與Southern轉(zhuǎn)移相同的方法將RNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上,然后與探針雜交。1材料：待檢測的RNA及制備好的探針。2設(shè)備：電泳儀，電泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自顯影盒，X-光片，雜交袋，硝酸纖維素膜或尼龍膜。3試劑：(1)20×SSPE:175.3gNaCl,88.2g檸檬酸鈉，溶于800ml水中，用10mol/LNaOH調(diào)pH至7.4,定溶到1L。(2)其他試劑：與Southern雜交試劑類似，只是所有的試劑均應(yīng)用DEPC處理。4操作步驟：(1)RNA經(jīng)變性電泳完畢后,可立即將乙醛酰RNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上。轉(zhuǎn)移方法與轉(zhuǎn)移DNA的方法相似。(2)轉(zhuǎn)移完畢后,以6×SSC溶液于室溫浸泡此膜5分鐘,以除去瓊脂糖碎片。(3)將該雜交膜夾于兩張濾紙中間,用真空烤箱于80℃干燥0.5-2小時(shí)。(4)用下列兩種溶液之一進(jìn)行預(yù)雜交，時(shí)間為1-2小時(shí)。若于42℃進(jìn)行,應(yīng)采用:50%甲酰胺，5×SSPE，2×Denhardt's試劑，0.1%SDS；若于68℃進(jìn)行,應(yīng)采用:6×SSC，2×Denhardt's試劑，0.1%SDS，（注意：BLOTTO不能用于Northern雜交）。(5)在預(yù)雜交液中加入變性的放射性標(biāo)記探針,如欲檢測低豐度mRNA,所用探針的量至少為0.1μg,其放射性比活度應(yīng)大于2×108cpm/分·μg,放在適宜的溫度條件下雜交16-24小時(shí)。(6)用1×SSC、0.1%SDS于室溫洗膜20分鐘,隨后用0.2×SSC、0.1%SDS于68℃洗膜3次,每次20分鐘。(7)用X光片(KodakXAR-2或與之相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品)進(jìn)行放射自顯影,附加增感屏于-70℃曝光24-48小時(shí)。[注意](1)如果瓊脂糖濃度高于1%，或凝膠厚度大于0.5cm，或待分析的RNA大于2.5kb,需用0.05mol/LNaOH浸泡凝膠20分鐘,部分水解。3.1Southern雜交的應(yīng)用Southern雜交技術(shù)自產(chǎn)生以后得到了廣泛的應(yīng)用而且技術(shù)還在不斷地完善和更新。在這里只是簡要的介紹幾種應(yīng)用的領(lǐng)域。（1）Southern雜交在乙肝病毒檢測中的應(yīng)用[3]在此方法中先是將HBV的表達(dá)體進(jìn)行表達(dá)，然后收集表達(dá)的DNA用化學(xué)發(fā)光標(biāo)記和檢測試劑盒將乙肝病毒基因片段標(biāo)記成探針，在與被檢測的DNA進(jìn)行Southern雜交最后完成后進(jìn)行電泳曝光檢查確定目標(biāo)是否感染乙肝病毒。此方法能快速準(zhǔn)確的檢測出乙肝病毒非常實(shí)用。（2）Southern雜交檢測乳腺癌骨髓微轉(zhuǎn)移[4]在此方法中是應(yīng)用腫瘤細(xì)胞特異或過量表達(dá)基因的檢測。主要檢測的是CK-19的特異性表達(dá)。對(duì)檢測者去骨髓確保準(zhǔn)確性，用CK-19作為探針來對(duì)骨髓進(jìn)行Southern雜交在雜交完成進(jìn)行點(diǎn)用實(shí)驗(yàn)，檢測CK-19的特異性條帶的存在。來作為判定的依據(jù)，此法比常規(guī)IHC法靈敏20倍能更早的檢測出乳腺癌骨髓微轉(zhuǎn)移，能提前做好預(yù)防和治療。3.2Nouthern雜交的應(yīng)用（1）Nouthern雜交在奶牛乳房炎抗性基因的帥選的應(yīng)用[5]分別用高辛標(biāo)記患乳房炎奶牛和健康奶牛外周血白細(xì)胞cDNA探針,對(duì)已構(gòu)建的奶牛乳房炎抗性相關(guān)cDNA文庫應(yīng)用反向Northern斑點(diǎn)雜交技術(shù)進(jìn)行差異篩選。最終確定哪些基因與奶牛乳房炎抗性有關(guān)。(2)Nouthern雜交在組織工程研究中的應(yīng)用[6]組織培養(yǎng)后將目的探針與組織培養(yǎng)后的產(chǎn)物進(jìn)行雜交，檢測aggrecanmRNA的表達(dá)狀況。在DNA雜交技誕生后為整個(gè)人類社會(huì)的發(fā)展做出了巨大的貢獻(xiàn)，它迅速的運(yùn)用于很多領(lǐng)域讓人類在DNA分子層面上得到了長足的進(jìn)步。我們可以發(fā)現(xiàn)任何一個(gè)科學(xué)技術(shù)的產(chǎn)生與發(fā)展都經(jīng)過了很大的挫折，我們要能堅(jiān)定自己的信念勇于追求才能有大的發(fā)展。所以我們?cè)谝院蟮纳a(chǎn)實(shí)際中也要秉承這種信念才能獲得成功。參考文獻(xiàn)：[1]米志勇,柯燦,王麗霞.DNA雜交測序法[J].生物工程進(jìn),1996,16(3):54-56[2]李慶春.DNA雜交及其在實(shí)踐中的應(yīng)用[J].中學(xué)生物教學(xué),2002,12:26[3]張秉強(qiáng)