DB21T 3273-2020 豬偽狂犬病毒野毒株與gE基因缺失疫苗株TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒別方法　　

DB21DB21/T3273—2020豬偽狂犬病毒野毒株與gE基因缺失疫苗株TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒別方法ATaqManReal-timePCRMethodforDifferentiationofWild-typeStrainfromgE-deletedVaccineStrainofPseudorabiesVirus2020-06-30發(fā)布2020-07-30實(shí)施遼寧省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布I 1 1 1 1 1 2 3 4 6 7標(biāo)準(zhǔn)起草單位通訊地址：遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心（沈陽(yáng)市皇姑區(qū)寧山東路29號(hào)），聯(lián)系電話：1本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬血液、組織臟器、精液、鼻腔拭子和細(xì)胞培養(yǎng)物等材料中PRV核酸的檢測(cè)以及PRVNY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技PRV偽狂犬病病毒（pseudorabie熒光PCR儀、高速冷凍離心機(jī)（可控溫至4℃,離心速度可達(dá)12000r/min以上）、組織研磨儀-20℃以下普通冰箱、-70℃以下超低溫冰箱、移液器（量程0.1μL～2μL、2μL～20μL、20μL~25.1DNAzol?Reagent：商品化DNA提取試劑，2℃~8℃普通冰箱中保存；或商品化核酸提取試劑盒（如磁珠法核酸提取試劑通常18℃~25℃保存。5.2無(wú)水乙醇：-20℃普通冰箱中預(yù)冷。5.375%乙醇：用無(wú)水乙醇和雙蒸水配制，-20℃普通冰箱中預(yù)冷。5.4PBS：磷酸鹽緩沖液（0.02mol/LpH7.2配制見(jiàn)附錄A。5.62×TaqManFastqPCRMasterMix：為商品化探針5.8陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照：陽(yáng)性對(duì)照使用PRV野毒株細(xì)編號(hào)備檢；組織臟器使用組織研磨儀或研缽進(jìn)行處理后3在試劑配制區(qū)進(jìn)行。gD基因和gE基因的反應(yīng)體系相同。設(shè)熒光qPCR反應(yīng)管數(shù)為n，n為待檢樣品數(shù)+陽(yáng)性對(duì)照管數(shù)+陰性對(duì)照管數(shù)，每個(gè)反應(yīng)體系見(jiàn)表1，配制體系時(shí)建議按照n+1個(gè)反應(yīng)進(jìn)行配制，配制反應(yīng)體系建議在冰盒中進(jìn)行；配制好的反應(yīng)液充分混勻后，按照每管18μL分裝于PCR反2×TaqManFastqPCRMasterMix上游特異性PCR引物（10μmol/L）下游特異性PCR引物（10μmol/L）TaqMan探針（10μmol/L）滅菌雙蒸水4將PCR反應(yīng)管放入熒光PCR儀內(nèi)，設(shè)置探針：5’端選gD和gE基因熒光qPCR反應(yīng)條件均為：94℃3min；94℃15s，60℃45s，收集熒光，40個(gè)循環(huán)。Ct值≤36，且擴(kuò)增曲線為典型的S型，報(bào)告為PRV核酸陽(yáng)性，但需進(jìn)一步經(jīng)gE基因檢測(cè)來(lái)進(jìn)行PRV野36＜Ct值≤38，判定為可疑，需從提取DNA開(kāi)始進(jìn)行一次重復(fù)檢測(cè)。如重復(fù)檢測(cè)結(jié)果仍為36≤38，且擴(kuò)增曲線均呈典型的S型擴(kuò)增曲線，報(bào)告為PRV核酸陽(yáng)性，但需進(jìn)一步經(jīng)gE基因檢測(cè)來(lái)進(jìn)行PRV536＜Ct值≤38，判定為可疑，需從提取DNA開(kāi)始進(jìn)行一次重復(fù)檢測(cè)。如重復(fù)檢測(cè)結(jié)果仍為36則判定為PRV核酸陰性，既無(wú)PRV野毒也無(wú)疫苗毒。針對(duì)未免疫缺失gE基因的PRV疫苗(△gE/PRV）的豬只，如果gD基因或gE基因檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，則判定為PRV野毒核酸陽(yáng)性；如果gD基因和gE基因檢6 A.18mmol/LNaOH溶A.2.20.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：稱(chēng)取磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）31.21g，先加適量去離子水溶7 FAM-ACCAGCACCGCACGTACAAG-BHQ1FAM-ACCAGACGTCGAAGCCGGA-B