PCR原理及檢測方法

PCR原理及檢測方法第1頁，共53頁。

一、PCR的定義：

PCR（polymerasechainreaction)：聚合酶鏈式反應，又稱體外DNA擴增技術。近年來發(fā)展起來的一種體外擴增特異DNA片段的技術。第2頁，共53頁。

PCR技術：1985年由美國Cetus公司的KaryMullis首創(chuàng)，可以將微量目的DNA片段擴增一百萬倍以上。優(yōu)點：敏感度高、特異性強、產率高、重復性好以及快速簡便等，廣泛應用于微生物學、考古學、法醫(yī)學及體育等領域，并已普及到許多普通實驗室，大大簡化了傳統(tǒng)的分子克隆技術，從而比較容易地對目的基因進行分析、鑒定。

KaryMullis本人因此獲1993年諾貝爾化學獎。第3頁，共53頁。

二、PCR的原理：

用于擴增位于兩段已知序列之間的DNA片段，類似于天然DNA的復制過程。

以擬擴增的DNA分子為模板，以一對分別與模板5′末端和3′末端互補的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復制的機制沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成，重復這一過程，即可使目的DNA片段得到擴增。第4頁，共53頁。

擴增的特異性取決于引物與模板DNA的特異結合，基本反應步驟分三步：1.變性(Denaturation)：加熱使模板DNA雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈。94℃30″2.退火(復性)(Annealling):突然降溫后模板DNA與引物按堿基配對原則互補結合，也存在兩條模板鏈之間的結合，但由于引物的高濃度，結構簡單的特點，主要的結合發(fā)生在模板與引物之間。55℃30″第5頁，共53頁。

3.延伸(Extension):將反應溫度調節(jié)到酶的最適溫度，在DNA聚合酶、4種dNTPs及鎂離子等存在的條件下，以引物的3′端開始，結合單核苷酸，形成與模板鏈互補的新DNA鏈。72℃1′

上述3步為一個循環(huán)，每經過一個循環(huán)，樣本中的DNA量應該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經過25～40個循環(huán)后DNA可擴增106～109倍。第6頁，共53頁。

PCR的基本反應步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C第7頁，共53頁。第8頁，共53頁。第9頁，共53頁。

PCR擴增的特異性是由一對寡核苷酸引物所決定的。反應初期，原來的DNA擔負起使模板的作用，隨著循環(huán)次數的遞增，由引物介導延伸的片段急劇增多而成為主要模板，最終的擴增產物是介于兩種引物5’端之間的DNA片段。第10頁，共53頁。

三、PCR的成分和作用：

1.緩沖液：

10

～50mMTris-Cl(pH8.4)維持Taq酶作用環(huán)境的偏堿性25～50mMKCl促進引物退火，>50mM會抑制Taq酶的活性。

100μg/ml牛血清白蛋白(BSA)對酶有一定的保護性，如質量不好將起相反的作用，建議使用乙酰化的BSA。明膠、Tween-20、二硫蘇糖醇(DTT)也有類似作用。第11頁，共53頁。2.MgCl2:

1.5～2.0mMTaq酶具有Mg2+依賴性，顯著影響反應的特異性和擴增片段的產量，過量能增加非特異擴增并影響產率，過低則酶活性顯著下降。第12頁，共53頁。3.dNTPs:dATP、dGTP、dCTP、dTTP——底物0.02～0.2mMdNTPs可與Mg2+結合，應注意Mg2+濃度與dNTPs

濃度之間的關系，Mg2+濃度比dNTPs濃度高0.2～2.5mM。過高：加快反應速度，還可增加堿基的錯誤摻入率和室驗成本。過低：反應速度下降，可提高實驗的精確性。第13頁，共53頁。4.引物(Primer-P)：預擴增核酸片段兩端的已知序列，決定特異性。

0.2～1μM

偏高：非特異產物擴增及錯配，增加引物之間形成引物二聚體，產量降低。偏低：產量降低。第14頁，共53頁。5.TaqDNA聚合酶：耐高熱0.5～5U/100μl

1U/25～50μl

偏高：引物非特異產物的擴增偏低：產物量降低第15頁，共53頁。6.模板DNA(Template):最低102～105bpDNA片段，實際用量遠遠超過此量，用量需在實驗中摸索。1～5μl

過高：非特異產物增加過低：產量降低7.水：

去離子水，補足整個反應體積。第16頁，共53頁。

四、PCR反應體系：

各種成分的實際用量應根據實驗者選用的該成分的終濃度及所擁有的儲備液濃度進行核算。第17頁，共53頁。

五、PCR反應條件優(yōu)化：

1、溫度、循環(huán)參數：

⑴變性溫度和時間：

保證模板DNA解鏈完全是保證整個PCR擴增成功的關鍵。加熱90～95℃，30～60s，再復雜的DNA分子也可變性為單鏈。根據模板DNA復雜程度，可以調整變性溫度和時間。一般情況下選擇94℃30″，可使各種復雜的DNA分子完全變性。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。第18頁，共53頁。

⑵復性溫度和時間：

PCR擴增特異性取決于復性過程中引物與模板的結合。復性溫度的選擇，可根據引物的長度和G+C含量確定，長度在15～25bp之間時，復性溫度Tm=4(G+C)+2(A+T)計算得到，一般位于40～60℃，30～60s。復性溫度越高，產物特異性越高。復性溫度越低，產物特異性越低。一般情況下選擇55℃30″，足以使引物與模板之間完全結合。第19頁，共53頁。

⑶延伸溫度和時間：一般位于Taq酶最適作用溫度70～75℃之間。引物小于16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結合，可以緩慢升溫到70～75℃。延伸反應時間，可根據待擴增片段的長度而定，<1Kb，1分鐘足夠；>1Kb需加長延伸時間，10Kb片段延伸時間可達15分鐘。延伸時間過長可出現(xiàn)非特異擴增，常用72℃1′。

第20頁，共53頁。

⑷循環(huán)數：其他參數選定后，PCR循環(huán)次數主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20～25次循環(huán)后，PCR產物的積累即可達到最大值，實際操作中由于每步反應的產率不可能達到100%，因此不管模板濃度是多少，20～30次是比較合理的循環(huán)次數。循環(huán)次數越多，非特異擴增增加。第21頁，共53頁。六、PCR擴增產物的分析常用瓊脂糖凝膠電泳上排：1：marker2：陰性對照3-17：標本（引物為CA16）下排：1-3：標本（引物為CA16）4：CA16引物的陽性對照5：marker6：陰性對照7-14：標本（引物為EV71）15：EV71引物的陽性對照第22頁，共53頁。RT-PCR技術RT-PCR是將RNA的反轉錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術。首先經反轉錄酶的作用從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉錄的RNA產物。無論使用何種RNA，關鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。第23頁，共53頁。Real-TimePCR技術

在實時熒光定量PCR反應中，引入了一種熒光化學物質，隨著PCR反應的進行，PCR反應產物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。第24頁，共53頁。TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，它的熒光與目的序列的擴增相關。它設計為與目標序列上游引物和下游引物之間的序列配對。熒光基團連接在探針的5’末端，而淬滅劑則在3’末端。第25頁，共53頁。當完整的探針與目標序列配對時，熒光基團發(fā)射的熒光因與3’端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進行延伸反應時，聚合酶的5’外切酶活性將探針進行酶切，使得熒光基團與淬滅劑分離，因而熒光基團發(fā)射出熒光信號。隨著擴增循環(huán)數的增加，釋放出來的熒光基團不斷積累。因此熒光強度與擴增產物的數量呈正比關系。第26頁，共53頁。

一般而言，熒光擴增曲線擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段,熒光信號指數擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，我們無法判斷產物量的變化。而在平臺期，擴增產物已不再呈指數級的增加。PCR的終產物量與起始模板量之間沒有線性關系，所以根據最終的PCR產物量不能計算出起始DNA拷貝數。只有在熒光信號指數擴增階段，PCR產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系，我們可以選擇在這個階段進行定量分析。第27頁，共53頁。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量PCR技術中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和CT值。熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在熒光信號指數擴增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環(huán)數被稱為CT值（thresholdvalue）。第28頁，共53頁。第29頁，共53頁。第30頁，共53頁。PCR檢測對標本采集及保存、

運輸的要求咽拭子、糞便、皰疹液、腦脊液等。用于病毒分離和核酸檢測的標本盡早采集。病毒儲存液保存。冷鏈運輸，盡快送至實驗室進行檢測。-20℃長期保存，但是流感樣病例標本應于-70℃長期保存第31頁，共53頁。新型甲型H1N1流感檢測第32頁，共53頁。核酸提取使用試劑：核酸提取試劑盒QIAGENRNeasyminikit（74104）；預冷的70%乙醇溶液（無RNase水配制）（自備）；β-巰基乙醇（自備）基本步驟：裂解組織，釋放核酸；除去蛋白雜質；最后獲得核酸產物第33頁，共53頁。注意事項：1提取核酸過程中使用的所有溶液和耗材必須經過特殊處理，確保無RNase2操作過程中必須盡量保持低溫，迅速3操作要在生物安全柜中進行，檢測標本樣品和試劑必須在生物安全柜中才可以打開操作中必須做好防護，防止降解，污染和感染；4提取好的核酸若不立即進行檢測，應于-20℃保存第34頁，共53頁。RT-PCR檢測1）反應體系配制（25ul體系）（在專門的生物安全柜中進行）：使用試劑盒：QIAGENonestepRT-PCRkit（210212）

RNasefreewater

11.9ul5×RT-PCR緩沖液

5ul10mMdNTP

1ulEnzymix

1ulRNasin

0.1ul

上游引物(20uM)0.5ul下游引物(20uM)0.5ul合計20ul第35頁，共53頁。對每一個建立的反應確定反應數（n=擬進行的PCR管數，包括陰性，陽性對）?？紤]到陰性無模板對照，陽性對照，誤差，制備過量的反應混合物是必要的。具體如下：（1）如果包括對照，樣品的數量（n）為1到14，那么N=n+1；（2）如果包括對照，樣品的數量（n）大于15，那么N=n+2。2）將上述反應液混勻，分裝到0.2mLPCR小管中，每管20μL，分別做好標記。3）加RNA模板（在核酸提取區(qū)）將上述分裝好的PCR小管分別加入模板。首先加入陰性對照管（5μL無菌水），然后分別加標本RNA（每管5μL），最后加入陽性對照RNA（每管5μL）。第36頁，共53頁。反應條件：1、60℃ 1分鐘 2、42℃ 10分鐘 3、50℃ 30分鐘 4、95℃ 15分鐘 5、94℃ 30秒 6、50℃ 30秒 7、72℃ 1分鐘 回到第5步 40個循環(huán) 8、72℃ 10分鐘9、end 第37頁，共53頁。電泳并觀察結果：

提前用1×的TBE緩沖液配制1.5-2%Agrorosegel，膠塊凝固后將其放置在加有1×TBE緩沖液的電泳槽中，電泳緩沖液必須淹沒膠塊。電泳液最好新鮮配制。PCR結束后，各取5ulPCR產物和1ul6×LoddingBuffer混勻，點樣，同時加DL2000Marker5ul，陰、陽性對照；電泳電壓：120V時間：膠塊的體積和濃度都對電泳時間有影響，一般30min-1h。根據LoddingBuffer中的溴芬蘭指示劑的位置來判斷電泳的程度，一般藍色指示條帶泳動到膠塊2/3位置處，就可以觀察結果了第38頁，共53頁。第39頁，共53頁。第40頁，共53頁。Real-timePCR檢測體系的配制（25ul體系）：RNasefreewater5.75ul2×MasterMix 12.5ulRT-Mix

0.25ulPrimer-1（40uM)

0.5ulPrimer-2(40uM)

0.5ulProbe(10uM)

0.5ul上述成分混勻，每管加入5ul待檢樣品的核酸，封蓋，上機。樣品多時，同RT-PCR體系的配制方法，混勻分裝。必須同時設定陰、陽性對照和空白對照第41頁，共53頁。第42頁，共53頁。反應條件：1、60℃5min2、50℃30min3、95℃15min4、95℃15s5、55℃30s6、72℃30s7、readplate8、gotostep4，for45cycles9、72℃5min10、readplate11、end第43頁，共53頁。第44頁，共53頁。注意事項RT-PCR引物稀釋方法--工作濃度（20μM） 配制方法：1．10×儲存液配制： （1）將新合成的引物在開蓋前短暫離心（12000rpm，15s）。 （2）用RNaseFreeWater溶解，加水量為10×總摩爾數，充分混勻，此時引物濃度為100pmol/μL，即100μM。 2．引物使用濃度配制：將100μM的引物濃度再5倍稀釋，配成濃度為20μM，即可直接用于PCR反應。（請注意各引物管實際所標記的OD數）第45頁，共53頁。Real-timePCR檢測引物和探針稀釋方法1．引物工作濃度（40μM）配制方法：（1）將新合成的引物開蓋前短暫離心（12000rpm，15s）。（2）用RNaseFreeWater溶解，加水量為10×總摩爾數，充分混勻，此時引物濃度為100μM，可作為儲存液。（例如：假設合成引物每管2OD，若1OD的量為4.75nmol（0.00475μmol），則一管引物的總摩爾數為2×4.75=9.5nmol，加水量為10×9.5＝95μl）（3）將100μM的引物2.5倍稀釋，此時濃度為40μM，可作為工作濃度。2．探針工作濃度（10μM）配制方法：（1）將新合成的探針管開蓋前短暫離心（12000rpm，15s）。（2）用RNaseFreeWater溶解，加水量為10×總摩爾數，充分混勻，此時引物濃度為100μM，可作為儲存液。（3）將100μM的探針10倍稀釋，此時濃度為10μM，可作為工作濃度。第46頁，共53頁。引物、探針稀釋后，-20℃保存陽性對照RNA收到后分裝成若干管，置-20℃或以下保存在試驗過程中，保持所有的試劑在冰架上保持低溫。使用的試劑必須從冷凍狀態(tài)徹底融化混勻后使用（1）分裝好的冰凍的引物和探針進行融化（已融的探針避光2-8℃可保存多達3個月，不要對探針反復凍融）；（2）渦旋振蕩引物和探針；（3）瞬時離心引物和探針，之后置于冰架上。第47頁，共53頁。材料及儀器第48頁，共53頁。

1、RNA提取試劑盒QIAGenRNeasyMiniKit（catalog#74104） 2、β－巰基乙醇（SIGMAβ-MercaptoethanolLot062K0115） 3、70%乙醇 4、RT-PCRKit：QIAGENOnestepRT-PCRKit（catalog#210212）；QIAGENquanteticprobeRT-PCRkit（catalog#204443） 5、RNasinRibonucleaseInhibitor（Promegacatalo