DB37T 2292-2013 刺參(種質(zhì))規(guī)范

ICS65.150B51DB37山東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局IDB37/T2292—2013本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省海洋與漁業(yè)廳提出。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省漁業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：山東省海洋水產(chǎn)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：孫國(guó)華、劉麗娟、任利華、姜向陽(yáng)、宋秀凱、孫偉、姜會(huì)超。1DB37/XXXXX—XXXX刺參（種質(zhì)）本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了刺參（Apostichopusjaponicus）的名稱(chēng)與分類(lèi)、主要形態(tài)特征、生長(zhǎng)與繁殖、分子遺傳學(xué)特性及檢測(cè)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于刺參的種質(zhì)檢測(cè)與鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T18654.1養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)種質(zhì)檢驗(yàn)第1部分檢驗(yàn)規(guī)則GB/T18654.2養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)種質(zhì)檢驗(yàn)第2部分抽樣方法3名稱(chēng)與分類(lèi)3.1學(xué)名刺參（Apostichopusjaponicus）。3.2分類(lèi)棘皮動(dòng)物門(mén)(Echinodermata)，海參綱（Holothuroidea），楯手目（Aspidochirota），刺參科（Stichopodidae），仿刺參屬（Apostichopus）。4主要形態(tài)特征4.1外部形態(tài)特征4.1.1體呈扁的圓筒形，兩端稍細(xì)，橫斷面略呈四角形。成參體長(zhǎng)一般20cm～40cm?？谠谇岸?，偏于腹面，肛門(mén)在后端，偏于背面?？谥苌?0個(gè)楯狀觸手。背、側(cè)面有大小不一、排列不規(guī)則的4列縱向肉刺。體色呈黃褐、黑褐、綠褐、純白或灰白等。體壁分為5個(gè)步帶區(qū)和5個(gè)間步帶區(qū)，彼此相間排列。腹面平坦，管足密集，排成不規(guī)則的3條縱帶。4.1.2刺參外部形態(tài)見(jiàn)圖1。1234535.2.1性成熟年齡b)增殖期：性腺多呈無(wú)色透明或淡黃色；c)生長(zhǎng)期：包括發(fā)育1期和2期。發(fā)育1期性腺逐漸增粗，分支增多，呈杏黃或淺橘紅色。發(fā)育2期性腺迅速發(fā)育，顏色變深，雌雄明顯可辨；d)成熟期：精巢呈乳黃色，卵巢呈橘紅色、半透明狀，卵粒清晰可見(jiàn)；e)排放期：出現(xiàn)自然排精、產(chǎn)卵現(xiàn)象。排放期后性腺退化進(jìn)入休止期。5.2.3產(chǎn)卵量成熟雌參可排卵1次~3次，可持續(xù)30min以上，產(chǎn)卵量一般在100萬(wàn)粒～200萬(wàn)粒，大個(gè)體可超1000萬(wàn)粒。6分子遺傳學(xué)特性6.1.1刺參群體30個(gè)個(gè)體中5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)PCR擴(kuò)增多態(tài)圖譜見(jiàn)圖2、圖3、圖4、圖5和圖6,微衛(wèi)星位點(diǎn)擴(kuò)增引物及條件見(jiàn)7.3.1。12345678910111213141516171234567891011121314151617圖2微衛(wèi)星位點(diǎn)Ajssr01擴(kuò)增圖譜圖3微衛(wèi)星位點(diǎn)Ajssr02擴(kuò)增圖譜412345678910111213141516171234567891011121314151617圖4微衛(wèi)星位點(diǎn)Ajssr03擴(kuò)增圖譜67891011121314151617181920-21222324267891011121314151617181920-212223242圖5微衛(wèi)星位點(diǎn)Ajssr04擴(kuò)增圖譜1234567891011121314151617圖6微衛(wèi)星位點(diǎn)Ajssr05擴(kuò)增圖譜6.1.25對(duì)微衛(wèi)星引物在刺參群體中共擴(kuò)增獲得23個(gè)等位基因，每個(gè)微衛(wèi)星座位檢測(cè)到的等位基因數(shù)為3個(gè)~7個(gè)。群體的觀測(cè)雜合度的平均值為0.4759,多態(tài)信息含量平均值為0.52493。6.216SrRNA序列6.2.1采用PCR技術(shù)對(duì)刺參線(xiàn)粒體16SrRNA(核糖體7.3.2.2,并將獲得序列進(jìn)行測(cè)序，獲得以下長(zhǎng)度為570bp的核苷酸序列：TCGCCTTGGTTTACAAAAACATAGCCCCACGAACTTCATATGTGGGGTGCAGCCTGCCCAGTGGAATTTATTGTATTTTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCACTTGTCTCTTAAATGGGGACCTGTATGAATGGCTTTTCACTCTCCCTCCCTCCTAATCTTCTAATCACGTGAAGAAGCGTGAACAAATAAGAAAGACGAGAAGACCCTGTCGAGCTTATGTCGTCTACCTTTTTTCTTAGAAAGAGGTAAATTTCAGATAAAGTTTTGGTTGGGGCAACCGTGGAGAAAAAGAATAGGAAGAAAACCTTTCACCTAAAAAATTTAGCGACCCAGTTACTCTGGTAAACGGAAAAAGTTACCGCAGGGATACTCTAAGAGCCCATATTGACGAGAAGGATTGCGACCTCGATGTTGGATTGGGGTAACCAAAGGGTGTAGCAGCTCTGTTCGTCCATTAACTCCCTACATGATCTGAGTT7檢測(cè)方法5DB37/XXXXX—XXXX7.1抽樣按照GB/T18654.2規(guī)定執(zhí)行。7.2體長(zhǎng)、體重檢驗(yàn)方法暫養(yǎng)于的干凈海水中30min以上，在無(wú)刺激自然伸展?fàn)顟B(tài)下測(cè)量刺參頭至尾為體長(zhǎng)；刺參從海水中撈出，靜置10min且排出腹腔大量海水后，以吸水濾紙除去表面水分，稱(chēng)量刺參體重。7.3分子遺傳學(xué)特性分析7.3.1微衛(wèi)星位點(diǎn)分析7.3.1.1DNA的提取取縱肌100mg剪碎后，放入600μL裂解液，55℃水浴消化至組織、碎塊完全裂解。裂解液分別用等體積的飽和酚、酚：三氯甲烷(1：1)、三氯甲烷：異戊醇(24：1)抽提，加入2倍體積的無(wú)水乙醇和終濃度10%的乙酸鈉離心沉淀DNA，最后用70%的乙醇洗2次后晾干。裂解液配方見(jiàn)附錄A。7.3.1.2微衛(wèi)星位點(diǎn)引物序列微衛(wèi)星位點(diǎn)引物序列見(jiàn)表2。表2微衛(wèi)星位點(diǎn)引物序列F:TGCAACGTTGATGTCAjssr02F:CAAACGCATACAATTACR:ATCGAACACAACACA7.3.1.3反應(yīng)條件95℃預(yù)變性6min；94℃變性50s，54℃退火溫度反應(yīng)50s，72℃延伸50s，30個(gè)循環(huán)；之后72℃5min，4℃保溫。反應(yīng)液配方見(jiàn)附錄A。7.3.1.4電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10%(w/v)聚丙烯酰胺凝膠電泳（恒功率60W），硝酸銀染色并檢測(cè)其多態(tài)性。聚丙烯酰胺凝膠及染色液配方見(jiàn)附錄B。7.3.2線(xiàn)粒體16SrRNA序列7.3.2.1DNA的提取同7.3.1.1。7.3.2.2引物序列6DB37/XXXXX—XXXX16Sf：5'-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3'；16Sr：5'-CCGGTCTAGACTCAGATCATG-3'。7.3.2.3反應(yīng)條件以提取的DNA為模板，利用兩個(gè)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件如下：94℃變性2min，1個(gè)循環(huán)；94℃變性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，1個(gè)循環(huán)。反應(yīng)液配方見(jiàn)附錄B。7.3.2.4片段回收、純化與序列測(cè)定PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收純化目的片段，用基因自動(dòng)分析儀測(cè)序，反應(yīng)程序按照所使用的測(cè)序試劑盒說(shuō)明書(shū)給出的規(guī)程操作，最后讀出16SrDNA的序列。7.4檢驗(yàn)規(guī)則與結(jié)果判定參照GB/T18654.1的規(guī)定執(zhí)行。7DB37/XXXXX—XXXX（規(guī)范性附錄）DNA提取裂解液和PCR擴(kuò)增反應(yīng)液組成A.1DNA提取裂解液DNA提取裂解液配制方法見(jiàn)表A.1。表A.1DNA提取液配制方法A.2擴(kuò)增PCR反應(yīng)液擴(kuò)增PCR反應(yīng)液配制方法見(jiàn)表A.2。表A.2擴(kuò)增PCR反應(yīng)液配制方法MgCl8DB37/XXXXX—XXXX（規(guī)范性附錄）聚丙烯酰胺凝膠及銀染液配方B.15倍TBE緩沖液5倍TBE緩沖液配制方法見(jiàn)表B.1。表B.15倍TBE緩沖液配制方法4℃保存?zhèn)溆谩.210%過(guò)硫酸銨溶液（APS）10%過(guò)硫酸銨溶液（APS）配制方法見(jiàn)表B.2。表