DB37T 3087-2017 豬偽狂犬病病毒gE基因PCR檢測(cè)技術(shù)

DB37IDB37/T3087—2017本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧獸醫(yī)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：陳蕾、杜以軍、齊靜、叢曉燕、孫文博、陳智、郭立輝、于江、吳家強(qiáng)、李俊、時(shí)建立。1實(shí)驗(yàn)室必須為生物安全Ⅱ級(jí)(BSL-2級(jí))及以上實(shí)驗(yàn)室。件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法GB/T27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范動(dòng)物檢疫5.1.1微量移液器(最大量程分別為10μL、20μL、100μL、1000μL),帶濾芯的槍頭。5.1.220000r/min低溫高速離心機(jī)。2DB37/T3087—20175.1.9燒杯(1000mL)。5.1.142℃~8℃冰箱。5.2試劑除另有規(guī)定外，所有生化試劑均為分析純。5.2.1蛋白酶K(見(jiàn)附錄A.1)。5.2.210%SDS液(見(jiàn)附錄A.2)。5.2.370%乙醇(見(jiàn)附錄A.3)。5.2.41.0%瓊脂糖凝膠(見(jiàn)附錄A.4)。PRV-Fwd:5-CTGGCTCTGCGTGCTGTG-3;PRV-Rev:5-GGTCCATTCGTCACTTCCG-3;擴(kuò)增片段長(zhǎng)度348bp。6操作程序臨床上豬的腦組織、淋巴結(jié)等，置于-20℃冰柜或液氮中保存。6.2DNA的提取用蛋白酶K裂解法提取總DNA。6.2.1取研磨液500μL于1.5mL離心管中，加入50μg/mL的蛋白酶K5μL,加入10%的SDS溶6.2.5取上清于一新離心管中，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，-20℃靜置20min,10000g離心15min,棄上清。3DB37/T3087—2017序號(hào)體系組成體系含量1滅菌雙蒸水2DNA310mmol/L上游引物410mmol/L下游引物510×PCRBuffer62.5mmol/LdNTPs7Taq酶瞬時(shí)離心，使液體都沉降到PCR管底。循環(huán)參數(shù)為95℃5min,94℃30s,60℃45s,72℃循環(huán)30次，72℃延伸10min結(jié)束。6.4電泳6.4.1制備1.0%瓊脂糖凝膠板，見(jiàn)附錄A.4。7.1在陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)348bp擴(kuò)增帶、陰性對(duì)照無(wú)此擴(kuò)增帶時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立(參見(jiàn)附錄A.5)。7.2被檢樣品出現(xiàn)348bp擴(kuò)增帶判定為偽狂犬病病毒gE基因陽(yáng)性，未出現(xiàn)相應(yīng)擴(kuò)增帶的樣品判定為偽狂犬病病毒gE基因陰性(參見(jiàn)附錄A.6)。4DB37/T3087—2017A.1蛋白酶K溶液(20mg/mL)試劑名稱用量蛋白酶K滅菌雙蒸水試劑名稱用量十二烷基硫酸鈉滅菌雙蒸水濃鹽酸調(diào)pH至7.2滅菌雙蒸水加至100mL試劑名稱用量無(wú)水乙醇滅菌雙蒸水試劑名稱用量瓊脂糖0.5×TBE緩沖液5DB37/T3087—2017348bpA.6檢測(cè)樣品