DB37T 3122-2018 槐花多糖提取工藝及其生物活性評價技術(shù)規(guī)程　

DB37DB37/T3122—2018槐花多糖提取工藝及其生物活性評價技術(shù)規(guī)程BiologicalActivityEvaluation山東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDB37/T3122—2018本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧獸醫(yī)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)、山東省動物疫病預(yù)防與控制中心負(fù)責(zé)起草。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：朱瑞良、魏凱、胡莉萍、孫振紅、黃河、郝智慧、閆振貴、王慧軍、裴宗飛。1DB37/T3122—2018槐花多糖提取工藝及其生物活性評價技術(shù)規(guī)程1范圍本規(guī)程適用于槐花多糖用作動物用免疫佐劑和免疫增強劑的制備和檢驗。件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T603化學(xué)試劑試驗方法中所用制劑及制品的制備GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB14925實驗動物環(huán)境及設(shè)施GB/T14926.54實驗動物血凝抑制試驗下列術(shù)語和定義適用于本文件。當(dāng)中的主要抗體。在腸道黏膜免疫當(dāng)中起到關(guān)鍵作用的是分泌型免疫球蛋白A(Secretory3.2血凝試驗(hemagglutinationtest,HA)是指某些病毒或病毒的血凝素能選擇性地使某種或某幾種動物的紅細(xì)胞發(fā)生凝集，這種凝集紅細(xì)胞的現(xiàn)象稱為血凝，也稱直接血凝反應(yīng)，利用這種特性設(shè)計的試驗稱血凝試驗。血凝抑制試驗(hemagglutinationinhibitiontest,HI)是指當(dāng)病毒的懸液中先加入特異性抗體，且這種抗體的量足以抑制病毒顆?；蚱溲?，則紅細(xì)胞表面的受體就不能與病毒顆?；蚱溲刂苯咏佑|，這時紅細(xì)胞的凝集現(xiàn)象就被抑制，稱為血凝抑制，利用這種特性設(shè)計的試驗稱血凝抑制試驗。3.32DB37/T3122—20184.1牛血清白蛋白(BSA),配制方法見附錄A。5.16分光光度計(380nm～780nm)。3DB37/T3122—20186.1采集新鮮盛開的槐花，去梗后放入恒溫干燥箱中于70℃烘干，用超微粉碎機粉碎成粉末狀，過40目篩，裝入密封袋，-20℃保存。6.2稱取一定量的槐花粉與去離子水按體積1:25混合，用pH計調(diào)節(jié)pH至4.5,加入終濃度0.25%的纖維素酶，45℃水浴中浸提1h,提取4次，合并4次上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至1/5體積。6.3濃縮液用Sevag試劑(配制方法見附錄A)除蛋白，重復(fù)兩次，最后加入4倍體積的無水乙醇使多糖沉淀，對析出的多糖進行離心，冷凍干燥后即為槐花多糖。7.290%苯酚液的配制量取苯酚90mL,用去離子水定容至100mL,即得90%苯酚液，棕色瓶7.36%苯酚液的配制將90%苯酚液稀釋至6%,即一體積儲存液對應(yīng)十四體積去離子水，臨用現(xiàn)配。放置20min,取出后用涼水冷卻10min,以0號作為空白調(diào)零，在最大吸收波長處(490nm)測定吸光歸方程。管號01234567葡萄糖(mL)苯酚液(mL)濃硫酸(mL)將提取得到的待測多糖用去離子水溶解，定容至100mL,取溶解后的溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線中的測定方法，以樣液為參比液，測定溶液的吸光值，按回歸方程計算待測溶液的多糖濃度，乘以稀釋倍數(shù)則為多糖含量。4DB37/T3122—2018用苯酚-硫酸法測的多糖含量大于80%以上，視為提取的槐花多糖合格。將240只SPF雛雞，隨機分為4組，每組60只。I、Ⅱ、Ⅲ組為試驗組，于9~12日齡，每天頸部皮下注射0.25mL槐花多糖溶液。其中I、Ⅱ、Ⅲ組槐花多糖含量分別為200mg/mL、100mg/mL、50mg/mL,IV組為對照組，注射生理鹽水。12日齡時各組免疫雞新城疫滅活苗，于免疫后3d、7d、14免疫7天后，各組隨機取15只雛雞，稱量體重(稱重前12h停飼停水),剖殺前采集血液(檢測后續(xù)指標(biāo)用),分別摘取胸腺、法氏囊、脾臟并稱重，計算出胸腺指數(shù)[胸腺重(g)/活體重(kg)],法氏囊指數(shù)[法氏囊重(g)/活體重(kg)],脾臟指數(shù)[脾臟重(g)/活體重(kg)]。血凝(HA)與血凝抑制(HI)試驗檢測雛雞血清抗體水平。血凝(HA)與血凝抑制(HI)試驗依據(jù)GB/T14926.54。用一次性醫(yī)用抗凝管采集各組雛雞的抗凝血1mL,用全自動血細(xì)胞分析儀測定雛雞血液內(nèi)白細(xì)胞雛雞剖殺后，取10cm長的十二指腸段，用3mL1%BSA-PBS反復(fù)沖洗3次后，8000rpm離心取上清，用商品化ELISA試劑盒檢測上清中SIgA的含量。5DB37/T3122—2018AA(資料性附錄)溶液的配制A.1.1牛血清白蛋白(BSA)的配制將100mg的牛血清白蛋白加入9.5mL水中(須將蛋白加入水中，而不是將水加入蛋白中),蓋好蓋后，輕輕搖動，直至牛血清白蛋白完全溶解為止。加水定容到10mL,然后分裝成小份貯存于-20℃。A.2Sevag試劑的配制氯仿：正丁醇=5:1(V/V)混合。A.3磷酸鹽緩沖溶液(PBS)的配制取ZLI-9061PBS溶于1000mL的蒸餾水中，混勻，測pH值應(yīng)在7.2~7.4之間，若偏離此范圍，請用A.41%雞紅細(xì)胞的配制A.4.1配制1%紅細(xì)胞懸液時最好選擇2～3只SPF雞或未進行過任何免疫過的成年公雞血液，采血時按十分之一采血量比例在一次性注射器中加入抗凝劑，如肝素或枸椽酸鈉等。A.4.2采血完畢后最好分裝至2mL容量的圓底離心管中，經(jīng)2000r/min~3000r/min,5min~10m