菌種的傳代、保藏及菌液課件

菌種的傳代、保藏及菌液制備菌種的傳代、保藏及菌液制備1標準菌種的概念及其管理標準菌種是指由國家授權機構制備的具有穩(wěn)定的生物學特性并用妥善方法保藏的菌種。我國的標準菌種統(tǒng)一由中國菌種保藏管理委員會（CCCCM）管理，涉及藥品微生物檢驗的菌種由醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心（CMCC）提供標準菌種的概念及其管理標準菌種是指由國家授權機構制備的具有穩(wěn)2菌種的名稱銅綠假單胞菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）１０１０４］生孢梭菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）６４９４１］大腸埃希菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）４４１０２］金黃色葡萄球菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）２６００３］沙門菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）５００９４］枯草芽孢桿菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）６３５０１］白色念珠菌［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００１］黑曲霉［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００３］菌種的名稱銅綠假單胞菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）１０１０４］3微生物菌種的使用、保存與管理、驗證。

一.制定菌種使用保藏管理程序（1）做好菌種的來源登記，確保溯源性清楚.（2）菌種的接收與復活標準菌種的保藏形式我國提供的標準菌種通常是以凍干粉的形式包裝于熔封的厚玻璃容器中。在這種容器中，微生物通常與賦形劑共存，由于缺乏生長必須的環(huán)境條件，一般呈休眠狀態(tài)。微生物菌種的使用、保存與管理、驗證。

一.制定菌種使用保藏管4培養(yǎng)基的選擇細菌一般用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，特別指出的是生孢梭菌用硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基加瓊脂制成的培養(yǎng)基進行傳代。真菌一般用改良馬丁培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的選擇細菌一般用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，特別指出的是生孢梭菌用5菌種的傳代菌種的復蘇菌種的確認菌種的接種菌種的保藏菌種的傳代菌種的復蘇6菌種的復蘇《中國藥典》2005版規(guī)定，所用標準菌種的傳代次數(shù)不得超過5代。從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥的菌種為第0代，冷凍干燥的原始菌種開啟后轉(zhuǎn)種后為第1代，直至到第3代為工作菌種。菌種的復蘇《中國藥典》2005版規(guī)定，所用標準菌種的傳代次數(shù)7嚴格控制菌種的傳代避免頻繁購買菌種及復壯等費時、耗力的工作。1.復溶菌種并轉(zhuǎn)種按菌種說明書要求復溶所轉(zhuǎn)菌種并轉(zhuǎn)接于適當?shù)脑鼍囵B(yǎng)基內(nèi)（為第一代）2.鑒定菌種后制甘油冷凍管經(jīng)菌種特性鑒定后，挑取純菌落制成濃菌懸液用于制備甘油冷凍管，保存管（為第二代）同時挑取純菌落接斜面，工作用菌種（為第三代）3.將第二代保存，第三代以適當溫度培養(yǎng)后用于試驗嚴格控制菌種的傳代避免頻繁購買菌種及復壯等費時、耗力的工作。84.取1支（第二代）冷凍保存管轉(zhuǎn)種于平板和斜面培養(yǎng)基上，平板上的菌種制成冷凍保存管（第三代）斜面養(yǎng)基適當溫度培養(yǎng)后作為工作用菌種（第三代）5.將（第三代）菌種冷凍或低溫保存，將生長、轉(zhuǎn)種后的第二代菌種滅菌處理。6.當工作用用菌種代數(shù)小于5時，可直接用上代工作用菌種轉(zhuǎn)接下代工作用菌（第三代）可直接轉(zhuǎn)接第四代，直至四代轉(zhuǎn)為五代。4.取1支（第二代）冷凍保存管轉(zhuǎn)種于平板和斜面培養(yǎng)基上，平板9菌種保藏標簽的規(guī)范與要求菌種保藏標簽必須規(guī)范、清晰，所有保藏的菌種容器表面均應貼有相應的標簽，標簽必須字跡清晰可見，應注明：菌種的名稱，系列號，傳代次數(shù)，接種時間等。一旦新一代菌種制備成功，上一代菌種務必處理掉處理過程應記錄。菌種保藏標簽的規(guī)范與要求菌種保藏標簽必須規(guī)范、清晰，所有保藏10嚴格菌種的質(zhì)量控制，確保菌種的質(zhì)量菌種的質(zhì)量對檢驗至關重要，對實驗式儲備的菌種而言，除了在起始階段要對菌種進行純度和屬性確認外，還應對每一次傳代都進行確認的質(zhì)量控制系統(tǒng)。因為微生物菌種從上一代傳到下一代時，很可能發(fā)生污染或變異，因此每次傳代中至少要對菌種進行形態(tài)學觀察和革藍染色檢查，必要時應做菌種鑒定試驗，所有被確認受到污染的菌種應及時銷毀，不得用于常規(guī)實驗。嚴格菌種的質(zhì)量控制，確保菌種的質(zhì)量菌種的質(zhì)量對檢驗至關重要，11菌種處理的注意事項與有關記錄菌種是特殊的標準品，在一定條件下，許多種類都是病原菌，這就要求處理菌種時有一些有別于其他標準品的特殊要求。1.根據(jù)菌株對人和動物的致病力、毒性流行傳染的危害程度，要實行嚴密安全的保藏管理。2.所有的與菌種有關聯(lián)的事情，例如菌種的接收、檢查和保藏等都應有專門的微生物分析員處理和控制，建立進出賬目，填寫菌種紀錄，紀錄內(nèi)容包括：菌種名稱、編號、來源、形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生化檢定、傳代次數(shù)、最適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件、保藏方法、儲存條件及保存庫址等。菌種處理的注意事項與有關記錄菌種是特殊的標準品，在一定條件下123.在操作過程中，必須嚴格遵守實驗室安全防護措施規(guī)程，采取有效預防措施進行自我保護。4.為了防止菌種污染或?qū)⑽廴緜鞑サ絼e處，其他部門的人員未經(jīng)允許不得進微生物實驗室。所有的意外情況，都必須立即向主管部門報告以便得到及時解決。5相關記錄在菌種的使用制備與保藏過程中，應建立菌種制備、保藏和使用的記錄格式。3.在操作過程中，必須嚴格遵守實驗室安全防護措施規(guī)程，采取有13菌種的確認一.初步鑒定試驗分離培養(yǎng)—菌落形態(tài)革蘭染色—菌體染色特性及菌形生化試驗—檢測細菌對各種基質(zhì)的代謝作用及代謝產(chǎn)物，借以鑒別細菌的種類菌種的確認一.初步鑒定試驗14二.全面鑒定

血清分型毒素分析—內(nèi)毒素和外毒素基因分型蛋白組分析自動化儀器分析（生化，酶學，基因序列等）二.全面鑒定

血清分型15銅綠假單胞菌形態(tài)特征：G-桿菌、直或微彎、較細長、散在排列、無芽胞、有莢膜、單端有1～3根鞭毛。培養(yǎng)特性：專性需氧，最適溫度為35℃，但在42℃生長是銅綠假單胞菌的一個特點。營養(yǎng)無特殊要求，普通培養(yǎng)基上均能生長，菌落大小不一，扁平濕潤，邊緣不齊，可產(chǎn)生各種水溶性色素，故使培養(yǎng)基變?yōu)樗{綠色。在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中呈均勻混濁生長，常在其表面形成菌膜。分離培養(yǎng)：十六烷三甲基溴化銨培養(yǎng)基生化反應：氧化酶試驗（＋）（培養(yǎng)物呈粉紅色漸變?yōu)樽霞t色）綠膿菌素試驗（＋）（鹽酸溶液呈粉紅色）銅綠假單胞菌形態(tài)特征：G-桿菌、直或微彎、較細長、散在排列、16銅綠假單胞菌—瓊脂平板的形態(tài)銅綠假單胞菌—瓊脂平板的形態(tài)17銅綠假單胞菌—鞭毛染色形態(tài)銅綠假單胞菌—鞭毛染色形態(tài)18生孢梭菌形態(tài)特征：G＋粗大芽胞桿菌、但在陳舊培養(yǎng)物中菌體革蘭染色為陰性，芽胞正圓形或卵圓形，直徑大于菌體，位于軍體中央或近端，有周身鞭毛，能運動。培養(yǎng)特性：專性厭氧，但要求不嚴格。一般培養(yǎng)時不易形成芽孢，在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基形成不規(guī)則菌落。在硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基加瓊脂制成的培養(yǎng)基上形成圓形、光滑、濕潤、不透明的菌落。在硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中常在其表面形成菌膜。生孢梭菌形態(tài)特征：G＋粗大芽胞桿菌、但在陳舊培養(yǎng)物中菌體革19大腸埃希菌形態(tài)特征：G-直短桿狀桿菌、無芽胞、有周身鞭毛，能運動。有菌毛。培養(yǎng)特性：兼性厭氧，營養(yǎng)要求不高，普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，形成較大的圓形、光滑、濕潤、灰白色的菌落。在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中呈均勻混濁生長。分離培養(yǎng)：伊紅美蘭培養(yǎng)基（EMB平板）生化反應：IMViC試驗結(jié)果：＋＋－－MUG試驗結(jié)果：熒光：＋

大腸埃希菌形態(tài)特征：G-直短桿狀桿菌、無芽胞、有周身鞭毛，20大腸埃希菌—EMB平板菌落形態(tài)大腸埃希菌—EMB平板菌落形態(tài)21大腸埃希菌—顯微鏡下菌體形態(tài)大腸埃希菌—顯微鏡下菌體形態(tài)22大腸埃希菌—電鏡下菌體形態(tài)大腸埃希菌—電鏡下菌體形態(tài)23金黃色葡萄球菌形態(tài)特征：G＋球菌、呈單個、成雙、短鏈或排列呈葡萄串樣，無鞭毛、芽胞。培養(yǎng)特性：兼性厭氧，營養(yǎng)要求不高，在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上形成較大的圓形、光滑、濕潤、隆起、邊緣整齊、不透明的菌落。菌落因種不同而出現(xiàn)不同的色素。在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中呈均勻混濁生長。分離培養(yǎng)：高鹽甘露醇培養(yǎng)基生化反應：血漿凝固酶試驗結(jié)果：＋

金黃色葡萄球菌形態(tài)特征：G＋球菌、呈單個、成雙、短鏈或排列24金黃色葡萄球菌—顯微鏡下菌體形態(tài)金黃色葡萄球菌—顯微鏡下菌體形態(tài)25金黃色葡萄球菌—電鏡下菌體形態(tài)金黃色葡萄球菌—電鏡下菌體形態(tài)26沙門菌形態(tài)特征：G-直桿菌、無芽胞、無莢膜、多具有周身鞭毛，能運動。有菌毛。培養(yǎng)特性：兼性厭氧，營養(yǎng)要求不高，普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上可生長，形成圓形、光滑、濕潤、半透明、邊緣整齊的菌落。在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中呈均勻混濁生長。分離培養(yǎng)：沙門菌屬志賀菌屬瓊脂(S.S)瓊脂培養(yǎng)基生化反應：三糖鐵瓊脂反應：堿/酸，葡萄糖產(chǎn)氣，H2S陽性多價血清凝集試驗：陽性沙門菌形態(tài)特征：G-直桿菌、無芽胞、無莢膜、多具有周身鞭27沙門菌—SS平板菌落形態(tài)沙門菌—SS平板菌落形態(tài)28沙門菌—顯微鏡下菌體形態(tài)沙門菌—顯微鏡下菌體形態(tài)29沙門菌—血清凝集試驗結(jié)果沙門菌—血清凝集試驗結(jié)果30枯草芽孢桿菌形態(tài)特征：G＋直桿菌、多呈鏈狀排列，有鞭毛、有芽胞，位于菌體中心或次極端，不小于菌體。培養(yǎng)特性：為需氧或兼性厭氧，營養(yǎng)要求不高，在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上形成較大的圓形或不規(guī)則的、表面粗糙、可有皺褶、菌落下面可形成紅色色素的灰白色菌落。在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中形成菌膜,很少混濁或不混濁。分離培養(yǎng)：營養(yǎng)瓊脂平板血瓊脂平板枯草芽孢桿菌形態(tài)特征：G＋直桿菌、多呈鏈狀排列，有鞭毛、有31枯草芽孢桿—瓊脂平板的形態(tài)枯草芽孢桿—瓊脂平板的形態(tài)32枯草芽孢桿—顯微鏡下菌體形態(tài)枯草芽孢桿—顯微鏡下菌體形態(tài)33真菌的初步鑒定試驗標本直接檢查—顯微鏡檢查真菌的分離培養(yǎng)⑴.酵母型菌落：是單細胞真菌的菌落。形態(tài)與一般細菌菌落相似，但較大些，菌落表面光滑、濕潤、邊緣整齊，有部分單細胞真菌可在培養(yǎng)基中形成假菌絲，此菌落稱為類酵母型菌落。⑵.霉菌型菌落：是多細胞真菌的菌落。菌落成棉絮狀、絨毛狀、粉末狀，并產(chǎn)生不同的色素?？焖亠@色鑒別培養(yǎng)法：經(jīng)37℃1～2d就能顯示結(jié)果。如白色念珠菌呈綠色或藍綠色菌落，黑曲霉呈白色絲狀菌落，里面呈淡粉紅色，一周后逐漸變成黑色。真菌的初步鑒定試驗標本直接檢查—顯微鏡檢查34霉菌各種菌落形態(tài)霉菌各種菌落形態(tài)35白色念珠菌形態(tài)特征：G＋、圓形或卵圓形、著色不均勻、在玉米培養(yǎng)基中可產(chǎn)生假菌絲和厚膜孢子。培養(yǎng)特性：在玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上形成灰白色、表面光滑、帶有濃重酵母氣味的典型的類酵母菌落。培養(yǎng)稍久，菌落增大。在改良馬丁培養(yǎng)基中呈沉淀生長。分離培養(yǎng)：快速顯色培養(yǎng)基白色念珠菌形態(tài)特征：G＋、圓形或卵圓形、著色不均勻、在玉米36白色念珠菌—顯色平板的形態(tài)白色念珠菌—顯色平板的形態(tài)37白色念珠菌—顯微鏡下菌體形態(tài)白色念珠菌—顯微鏡下菌體形態(tài)38黑曲霉形態(tài)特征：單層和雙層瓶梗、孢子頭球形放射狀、褐至黑色、孢子梗無色至褐色。培養(yǎng)特性：在玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上形成菌落初為白色羊毛狀，繼而黑色或黑褐色，粗絨狀。分離培養(yǎng)：快速顯色培養(yǎng)基黑曲霉形態(tài)特征：單層和雙層瓶梗、孢子頭球形放射狀、褐至黑色39黑曲霉—顯微鏡下菌體形態(tài)黑曲霉—顯微鏡下菌體形態(tài)40黑曲霉—電鏡下菌體形態(tài)黑曲霉—電鏡下菌體形態(tài)41菌種傳代的工作環(huán)境、工具及其他器皿環(huán)境1、潔凈工作室：環(huán)境潔凈度10000級下的局部100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)，全過程必須無菌操作，防止微生物污染。2、無菌隔離艙工具1、接種環(huán)2、接種針3、接種鏟4、接種鉤5、酒精燈及其他玻璃器械培養(yǎng)所用器具1、玻璃器皿：如各種規(guī)格培養(yǎng)皿。2、微生物實驗室常用的設備，如高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱等菌種傳代的工作環(huán)境、工具及其他器皿環(huán)境42菌種的接種操作步驟一.斜面接種法：1.從冷藏箱中取出菌種斜面后，應在室溫放置約30分鐘。2.將裝有新鮮配制的培養(yǎng)基菌種保藏管管壁上注明菌名及接種日期，和傳代菌種一并移入接種室或超凈工作臺。打開紫外燈照射一小時。菌種的接種操作步驟一.斜面接種法：433.關閉紫外燈。點燃酒精燈，左手握住菌種斜面，將管口靠近火焰上方，右手拿接種棒后端，將接種環(huán)燒紅約30秒，隨后將接種棒金屬部分在火焰上燒灼，往返通過三次。4.右手用無名指、小指及掌部夾住管塞，左手將管口在火焰上旋轉(zhuǎn)燒灼，右手再輕輕拔開管塞，將接種環(huán)伸入管內(nèi)先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取少量菌苔，隨即取出接種棒并將菌種管口移至火焰上方。3.關閉紫外燈。點燃酒精燈，左手握住菌種斜面，將445.塞上管塞，左手將菌種管放下，取營養(yǎng)瓊脂斜面（或改良馬丁瓊脂斜面）一支，照上述操作打開管塞，將接種環(huán)伸入管內(nèi)至瓊脂斜面的底部向上劃一條直線，然后從底部向上作連續(xù)曲線劃線，一直劃到斜面頂端，使細菌接種在斜面的表面上。6.取出接種環(huán)，在火焰上方將培養(yǎng)基管蓋上塞子，然后將接種過細菌的接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌。7.將已接種好的細菌管置35～37℃細菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)22～24h，霉菌管置23～28℃霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天。5.塞上管塞，左手將菌種管放下，取營養(yǎng)瓊脂斜面（或改良馬45二.穿刺接種法：用接種針取細菌少許，從培養(yǎng)基的中央垂直刺入，接近管底但不接觸管底，然后接種針沿穿刺線原路退出。主要用于生孢梭菌的傳代。三.液體接種法：用接種針取菌少許，在試管內(nèi)壁與液面交界處的管壁上輕輕研磨，使菌混合于培養(yǎng)液中。二.穿刺接種法：46黑曲霉接種方法：黑曲霉孢子懸液，可以保存在4℃環(huán)境，并應在一個月內(nèi)盡快完成轉(zhuǎn)種操作。轉(zhuǎn)種操作應在超凈工作臺（或相當此環(huán)境）中進行，關閉風機，靠近酒精燈，擰開瓶蓋，用無菌吸管吹吸管內(nèi)液體，取1～2滴滴在改良馬丁瓊脂斜面，用吸管涂布均勻，置23～28℃培養(yǎng)5～7日，培養(yǎng)斜面形態(tài)可參照下圖。

如上圖，斜面正面為黑褐色厚絨狀，色澤均一，不應有雜色；斜面?zhèn)让鏌o色，接近菌層培養(yǎng)基略帶黃色。轉(zhuǎn)種完畢的凍存管和使用過的器具應經(jīng)121℃濕熱滅菌30分鐘再作處理。黑曲霉接種方法：黑曲霉孢子懸液，可以保存在4℃環(huán)境，并應在一47菌種的保藏

菌種是重要的生物資源，研究和選擇良好的菌種保藏方法具有重要的意義。一、菌種保藏的目的

菌種保藏的重要意義就在于盡可能保持其原有性狀和活力的穩(wěn)定，確保菌種不死亡、不變異、不被污染，以達到便于研究、菌種的保藏菌種是重要的生物資源，研究和選48二、菌種保藏的原理首先應該挑選典型菌種的優(yōu)良純種來進行保藏，最好保藏它們的休眠體，如分生孢子、芽孢等。其次應人為地創(chuàng)造環(huán)境條件（如：干燥、低溫和缺氧），使微生物長期處于代謝不活潑、生長繁殖受抑制的休眠狀態(tài)。盡可能多的采用不同的手段保藏一些比較重要的微生物菌株二、菌種保藏的原理首先應該挑選典型菌種的優(yōu)良純種來進行保藏，49三、菌種保藏方法各種微生物由于遺傳特性不同，因此適合采用的保藏方法也不一樣。一種良好的有效保藏方法，首先應能保持原菌種的優(yōu)良性狀長期不變，同時還須考慮方法的通用性、操作的簡便性和設備的普及性。三、菌種保藏方法各種微生物由于遺傳特性不同，因此適合采用的保50

斜面低溫保藏法甘油冷凍管保藏法試管熔封（密封）保藏法石蠟油封藏法砂土管保藏法麩皮保藏法冷凍真空干燥保藏法液氮超低溫保藏法斜面低溫保藏法51（一）斜面低溫保藏法－常用保藏法將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，待菌種生長完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定時間（保藏期）再轉(zhuǎn)接至新的斜面培養(yǎng)基上，生長后繼續(xù)保藏，如此連續(xù)。此法適用于細菌、霉菌、酵母菌及放線菌保藏短期保藏.此法的主要保藏措施是低溫。一般可保存1～6個月左右。優(yōu)點：簡便易行、容易推廣，適用于大多數(shù)微生物缺點：菌株仍有一定程度的代謝活動能力，保藏期短；傳代次數(shù)多；菌種容易發(fā)生變異和被污染。（一）斜面低溫保藏法－常用保藏法將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基52（二）甘油冷凍管保藏法將待保藏菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，適宜溫度下培養(yǎng)適宜時間后，用無菌接種環(huán)輕輕刮取菌苔，通過接種環(huán)與試管壁之間的輕輕摩擦使細菌充分擴散到預先裝于試管中的無菌蒸餾水中，調(diào)正菌液濃度，使其等同于麥氏比濁管第10號管，向已制備好的菌懸液中加入等體積、濃度為20%的無菌甘油，得到10%甘油菌懸液。輕輕振搖小管，使內(nèi)容物充分混合，分裝無菌小管，最好在-30℃條件下儲存，一般可保存2年.（二）甘油冷凍管保藏法將待保藏菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，53（三）試管熔封（密封）保藏法熔封用各種瓊脂斜面（普通肉湯等）常規(guī)滅菌后，經(jīng)接種，室溫培養(yǎng)24～48h后，將接種菌生長旺盛的試管用噴燈將其管口熔封，分別置室溫和冰箱下保存。使用時，用砂輪在管口劃一圈，在乙醇燈下火煙滅菌后敲開管口即可轉(zhuǎn)接到另一斜面上。室溫保存期可達3年，特別是適宜一些因培養(yǎng)物陳舊極易死亡的銅綠假單菌。（三）試管熔封（密封）保藏法熔封用各種瓊脂斜面（普通肉湯54密封將需保存種菌按無菌操作要求接種至固體培養(yǎng)基塞緊棉塞，放在干燥器內(nèi)，干燥器密封處涂上凡士林，蓋緊后使之與真空泵相連接。開動真空泵抽真空30min至1h（真空度約為640）關閉密封口，撥出膠塞，置于室溫下保存。待用時，打開蓋，取出種菌，接種至培養(yǎng)基上即可。密封將需保存種菌按無菌操作要求接種至固體培養(yǎng)基塞緊棉塞，55（四）石蠟油封藏法此法是在無菌條件下，將滅過菌并已蒸發(fā)掉水分的液體石蠟倒入培養(yǎng)成熟的菌種斜面（或半固體穿刺培養(yǎng)物）上，石蠟油層高出斜面頂端1cm，使培養(yǎng)物與空氣隔絕，加硅膠塞并用固體石蠟封口后，垂直放在室溫或4℃冰箱內(nèi)保藏。此法的主要保藏措施是低溫、阻氧。一般可保存1～2年左右。（四）石蠟油封藏法此法是在無菌條件下，將滅過菌并已蒸發(fā)掉水分56（五）冷凍真空干燥保藏法又稱冷凍干燥保藏法，簡稱凍干法。它通常是用保護劑制備擬保藏菌種的細胞懸液或孢子懸液于安瓿管中，再在低溫下快速將含菌樣凍結(jié)，并減壓抽真空，使水升華將樣品脫水干燥，形成完全干燥的固體菌塊。并在真空條件下立即熔封，造成無氧真空環(huán)境，最后置于低溫下，使微生物處于休眠狀態(tài)，而得以長期保藏。此法適用于各大類微生物。此法的主要保藏措施是低溫、干燥、缺氧、有保護劑，保藏期一般長達5～15年，存活率高，變異率低，是目前被廣泛采用的一種較理想的保藏方法。該法操作比較煩瑣，技術要求較高，且需要凍干機等設備。（五）冷凍真空干燥保藏法又稱冷凍干燥保藏法，簡稱凍干法。它通57（六）液氮超低溫保藏法簡稱液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亞砜等作為保護劑，在液氮超低溫（－196℃）下保藏的方法。其主要原理是菌種細胞從常溫過渡到低溫，并在降到低溫之前，使細胞內(nèi)的自由水通過細胞膜外滲出來，以免膜內(nèi)因自由水凝結(jié)成冰晶而使細胞損傷。此法適用于各種微生物菌種的保藏。此法的主要保藏措施是超低溫、有保護劑，保藏期一般可達到15年以上，是目前公認的最有效的菌種長期保藏技術之一。此法的優(yōu)點是操作簡便、高效，且可使用各種培養(yǎng)形式的微生物進行保藏。其缺點是需購置超低溫液氮設備，且液氮消耗較多，操作費用較高。（六）液氮超低溫保藏法簡稱液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二58菌種的保藏條件及時間菌種培養(yǎng)基保存條件及時間大腸埃希菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基4℃~6℃保存2~3個月金黃色葡萄球菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基4℃~6℃保存2~3個月枯草芽孢桿營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基4℃~6℃保存3~6個月銅綠假單胞菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基室溫沙門菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基4℃~6℃保存2~3個月生孢梭菌硫乙醇酸鹽培基4℃~6℃保存6個月以上白色念珠菌改良馬丁培養(yǎng)基4℃~6℃保存4~6個月黑曲霉改良馬丁培養(yǎng)基4℃~6℃保存4個月菌種的保藏條件及時間菌種培養(yǎng)基保存條件及時間大腸埃希菌營養(yǎng)瓊59菌液的制備取銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物少許接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物少許接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中置35～37℃細菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24h；白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物少許接種至改良馬丁培養(yǎng)基中置23～28℃霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。菌液的制備取銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌60黑曲霉的菌液制備：將黑曲霉的孢子接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，于23～28℃霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7天，使大量的孢子產(chǎn)生。加入3～5ml的0.9%無菌氯化鈉溶液，用無菌玻棒或接種環(huán)輕輕將孢子洗脫，然后，用一支管口塞有無菌棉花的無菌球形毛細吸管吸出孢子菌液至無菌試管內(nèi)，可用比濁法或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基注皿（1ml），按規(guī)定條件培養(yǎng)后計數(shù)。黑曲霉的菌液制備：61菌液的稀釋方法菌液的稀釋方法62細菌的生長曲線細菌群體的生長繁殖可分為四期：

一期：遲緩期（lagphase）細菌接種至培養(yǎng)基后，對新環(huán)境有一個短暫適應過程（不適應者可因轉(zhuǎn)種而死亡）。此期曲線平坦穩(wěn)定，因為細菌繁殖極少。遲緩期長短因種類、接種菌量、菌齡以及營養(yǎng)物質(zhì)等不同而異，一般為1～4小時。此期中細菌體積增大，代謝活躍，為細菌的分裂增殖合成、儲備充足的酶、能量及中間代謝產(chǎn)物。

細菌的生長曲線細菌群體的生長繁殖可分為四期：

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二期：對數(shù)期(logarithmicphase)又稱指數(shù)期(exponentialphage)。此期生長曲線上活菌數(shù)直線