微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)

廣州大澳化妝品有限公司章節(jié)號(hào)ISO9001：2008之8.2.4編號(hào)WI/DAA0-PG-007A-2009微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)版次A/0頁(yè)碼共25頁(yè)，第1頁(yè)文件更改記錄更改單號(hào)更改頁(yè)碼更改內(nèi)容修訂版本狀態(tài)更改人審核人批準(zhǔn)人廣州大澳化妝品有限公司章節(jié)號(hào)ISO9001：2008之8.2.4編號(hào)WI/DAAO-PG-007A-2009微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)版次A/0頁(yè)碼共25頁(yè)，第2頁(yè)1目的：為了確保本公司生產(chǎn)的產(chǎn)品及外購(gòu)產(chǎn)品的微生物符合本公司的要求，使投放市場(chǎng)的產(chǎn)品符合國(guó)家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)和消費(fèi)者的需要，結(jié)合我公司的實(shí)際情況，特制定本規(guī)范。2．范圍：本公司車間微生物控制、原料、半成品、成品。3.定義：（無(wú)）4．職責(zé)：品管部：負(fù)責(zé)車間環(huán)境、人員、水質(zhì)、設(shè)備及原料、半成品、成品的微生物檢驗(yàn)，并進(jìn)行不合格產(chǎn)品的處理跟蹤，負(fù)責(zé)及時(shí)將車間衛(wèi)生指標(biāo)、原料、半成品、成品的微生物控制信息反饋給工廠，防止不合格半成品進(jìn)入下一道程序及不合格成品流入市場(chǎng)，負(fù)責(zé)對(duì)文件的整理及各種報(bào)表的統(tǒng)計(jì)。5檢驗(yàn)流程：廣州大澳化妝品有限公司章節(jié)號(hào)ISO9001：2008之8.2.4編號(hào)WI/DAA0-PG-007A-2011微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)版次A/0頁(yè)碼共25頁(yè)，第3頁(yè)責(zé)任部門(mén)微生物檢驗(yàn)控制流程說(shuō)明品管部OKOKA5A6A4器皿、培養(yǎng)基準(zhǔn)備滅菌取樣微檢操作A2工廠計(jì)劃部A3合格不合格復(fù)檢合格不合格出具檢驗(yàn)報(bào)告品管部經(jīng)理審核執(zhí)行不合格品控制流程半成品成品空氣、水原料、包材機(jī)器設(shè)備、個(gè)人衛(wèi)生A1A1.檢驗(yàn)員根據(jù)當(dāng)天的《工廠日生產(chǎn)計(jì)劃）》準(zhǔn)備當(dāng)天需要消毒的器皿及培養(yǎng)基的數(shù)量及培養(yǎng)基。A2.檢驗(yàn)員將準(zhǔn)備好的器皿、培養(yǎng)基進(jìn)行121攝氏度，0.1MPa滅菌20分鐘。A3.1每天上午9：00左右半成品檢驗(yàn)員嚴(yán)格按照無(wú)菌操作對(duì)前一天生產(chǎn)的半成品或工廠發(fā)出的余料檢驗(yàn)通知單按照半成品的取樣方法進(jìn)行取樣。2成品由車間巡檢員按照成品取樣方法進(jìn)行取樣，下午3-4點(diǎn)時(shí)由微生物檢驗(yàn)員將樣品取回檢驗(yàn)。3微生物檢驗(yàn)員每天上午完成對(duì)灌裝間的空氣，個(gè)人衛(wèi)生，包材容器的取樣，下午完成對(duì)制作間空氣、各個(gè)出水口，及工藝研發(fā)中心，品管部實(shí)驗(yàn)室各個(gè)去離子出水口的取樣并檢測(cè).4原料檢驗(yàn)員根據(jù)原料取樣方法進(jìn)行取樣，根據(jù)原料檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)需要檢微生物的原料進(jìn)行分裝并通知微生物進(jìn)行檢驗(yàn).A4檢測(cè)項(xiàng)目：為細(xì)菌總數(shù)、霉菌、致病菌（糞大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌）。檢驗(yàn)方法見(jiàn)本節(jié)附件。檢驗(yàn)完畢半成品填寫(xiě)《半成品檢測(cè)報(bào)告》中微生物欄中內(nèi)容，其它指標(biāo)（如理化指標(biāo)等）均檢驗(yàn)合格后，則簽署《半成品檢測(cè)報(bào)告明細(xì)表》同時(shí)填寫(xiě)《半成品檢測(cè)結(jié)果反饋單》審核后轉(zhuǎn)交給工廠計(jì)劃部安排灌裝計(jì)劃。成品檢驗(yàn)完畢填寫(xiě)《成品檢測(cè)報(bào)告》微生物欄中內(nèi)容，待其它指標(biāo)（如理化指標(biāo)，凈含量指標(biāo)等）均檢驗(yàn)合格后，填寫(xiě)《成品檢測(cè)報(bào)告明細(xì)表》審核后，交工廠計(jì)劃部安排成品出庫(kù)。A5檢測(cè)合格出檢驗(yàn)報(bào)告經(jīng)品管經(jīng)理審核后交工廠計(jì)劃部進(jìn)入下一工序.A6檢測(cè)不合格半成品、成品、樣板、外購(gòu)件、原料需要分析原因嚴(yán)格控制從取樣到檢測(cè)的各個(gè)程序，加嚴(yán)復(fù)檢，復(fù)檢合格，出具檢驗(yàn)報(bào)告，復(fù)檢不合格則執(zhí)行＜不合格品控制流程.＞而空氣、水、機(jī)器設(shè)備、個(gè)人衛(wèi)生檢驗(yàn)不合格則直接執(zhí)行＜不合格品控制流程＞。廣州大澳化妝品有限公司章節(jié)號(hào)ISO9001：2008之8.2.4編號(hào)WI/DAAO-PG-007A-2011微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)版次A/0頁(yè)碼共25頁(yè)，第4頁(yè)6.操作規(guī)范6.1滅菌6.1.1根據(jù)當(dāng)天《工廠日生產(chǎn)計(jì)劃》確定當(dāng)天的檢驗(yàn)項(xiàng)目和樣品數(shù)量，對(duì)所需要的器皿（包括稀釋用的生理鹽水、取水及半成品的燒杯、移液管、培養(yǎng)皿、取樣用的藥匙）和培養(yǎng)基（卵磷脂－土溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、乳糖膽鹽培養(yǎng)基、SCDLP培養(yǎng)基、BP培養(yǎng)基、十六烷培養(yǎng)基等）進(jìn)行高溫高壓滅菌；該項(xiàng)準(zhǔn)備工作一般在上午八點(diǎn)到十點(diǎn)進(jìn)6.2采樣.1.1空氣指標(biāo)：采用空氣沉降法分別對(duì)二次更衣室、灌裝間、普通儲(chǔ)膏間、凈化儲(chǔ)膏間、消毒包材暫存間、緩沖間、制作間、大料間、小料間、配料間進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定時(shí)間一般為周二、四、六10：30－11：00及15：00－15：30進(jìn)行。其中制作間、大小料間、二次更衣室的微生物指標(biāo)僅作衛(wèi)生質(zhì)量控制的去離子水：備無(wú)菌燒杯用無(wú)菌操作對(duì)制作間的8個(gè)出水口及品管部實(shí)驗(yàn)室和研究所實(shí)驗(yàn)室去離子水進(jìn)行采樣；采樣時(shí)間一般為周一、三、五14：00－14：30進(jìn)行人員衛(wèi)生：采用生理鹽水涂抹法對(duì)在灌裝間進(jìn)行灌裝的人員及可能接觸膏體人員的手部、無(wú)菌服進(jìn)行采樣；采樣時(shí)間為周一至六10：00－11：00設(shè)備及消毒好包材：對(duì)灌裝間灌裝機(jī)及所有接觸膏體的設(shè)備，及制作間、儲(chǔ)膏間消毒好的儲(chǔ)料桶及消毒包材暫存間的已消毒包材進(jìn)行采樣，采樣方法同原料：由原料檢驗(yàn)員用滅菌過(guò)的燒杯、勺半成品：由常規(guī)理化檢驗(yàn)員用滅菌過(guò)的燒杯、勺到半成品成品：包裝質(zhì)控員依據(jù)“樣板管理指導(dǎo)書(shū)”對(duì)每天灌裝的成品進(jìn)行取樣，微生物檢驗(yàn)員每天15：30供檢驗(yàn)樣品，應(yīng)嚴(yán)格保持原有的包裝狀態(tài)。容器不應(yīng)有破裂，在檢驗(yàn)前不得打開(kāi)，防止樣品污染。接到樣品后，應(yīng)立即登記，編寫(xiě)檢驗(yàn)序號(hào)，并按要求盡快檢驗(yàn)。如不能及時(shí)檢驗(yàn)，樣品應(yīng)放在無(wú)菌室內(nèi)。6.2.2若只有一個(gè)樣品而同時(shí)需做多種分析，則宜先取出部分樣品做微生物檢驗(yàn)，再將剩余樣品做其它分析。在檢驗(yàn)過(guò)程中，從打開(kāi)包裝全部檢驗(yàn)操作結(jié)束，均須防止微生物的再污染和擴(kuò)散，所用器皿及材料均應(yīng)事先滅菌，全部操作應(yīng)在無(wú)菌室內(nèi)進(jìn)行，或在相應(yīng)條件下，按無(wú)菌操作規(guī)定進(jìn)行。6.3檢驗(yàn)表1微生物檢驗(yàn)指標(biāo)檢驗(yàn)指標(biāo)要求檢驗(yàn)方法（見(jiàn)附件）細(xì)菌總數(shù)見(jiàn)表2細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定霉菌和酵母菌總數(shù)見(jiàn)表2霉菌和酵母菌測(cè)定糞大腸菌群不得檢出糞大腸菌群金黃色葡萄球菌不得檢出金黃色葡萄球菌綠膿桿菌不得檢出綠膿桿菌廣州大澳化妝品有限公司章節(jié)號(hào)ISO9001：2008之8.2.4編號(hào)WI/DAAO-PG-007A-2011微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)版次A/0頁(yè)碼共25頁(yè)，第5頁(yè)表2微生物檢驗(yàn)項(xiàng)目細(xì)菌、霉菌和酵母菌數(shù)量控制標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)項(xiàng)目要求/(CFU/g)檢驗(yàn)周期參照標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌霉菌和酵母菌半成品≤50≤30每批次化妝品衛(wèi)生規(guī)范（2007年版）成品≤50≤30每批次生產(chǎn)用水≤10≤3一周三次化妝品生產(chǎn)用水的微生物學(xué)檢驗(yàn)原料參照原料COA每批次原料中COA要求化妝品原料的微生物檢驗(yàn)車間空氣凈化標(biāo)準(zhǔn)車間——一周三次生產(chǎn)車間空氣中的微生物檢測(cè)30萬(wàn)級(jí)制作間≤15≤1010萬(wàn)級(jí)消毒包材暫存間≤10≤310萬(wàn)級(jí)凈化儲(chǔ)膏間≤10≤310萬(wàn)級(jí)普通儲(chǔ)膏間≤10≤310萬(wàn)級(jí)灌裝間≤10≤330萬(wàn)級(jí)大、小料間≤15≤1030萬(wàn)級(jí)二次更衣室≤15≤10生產(chǎn)設(shè)備及環(huán)境物體表面≤5≤3每天一次化妝品生產(chǎn)設(shè)備及環(huán)境物體表面微生物檢驗(yàn)消毒包材及生產(chǎn)人員手部≤5≤3每天一次化妝品包裝及生產(chǎn)人員的微生物檢驗(yàn)工衣≤50≤5備注：a：眼部、唇部用兒童用化妝品≤5006.3.1微生物檢驗(yàn)員按表1、表2中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)樣品在無(wú)菌室里生物安全柜進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)操作。6.3.2細(xì)菌總數(shù)、霉菌、致病菌（糞大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌）檢驗(yàn)方法、所需試劑及6.3.3原料、半成品、成品第一次檢測(cè)不合格者，應(yīng)按無(wú)菌操作法重新取樣，實(shí)行加嚴(yán)檢驗(yàn)（梯度稀釋，最少做三個(gè)梯度），如該檢驗(yàn)結(jié)果為合格者則判定該樣品最終檢測(cè)結(jié)果為合格，否則為不合格。6.3.4復(fù)檢樣品應(yīng)做平行樣，根據(jù)第一次檢驗(yàn)結(jié)果可加大稀釋度倍數(shù) 廣州大澳化妝品有限公司章節(jié)號(hào)ISO9001：2008之8.2.4編號(hào)WI/DAAO-PG-007A-2011微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)版次A/0頁(yè)碼共25頁(yè)，第6頁(yè)6.4品質(zhì)驗(yàn)證結(jié)果的判定及處理微生物檢驗(yàn)員將檢驗(yàn)結(jié)果如實(shí)的填寫(xiě)《微生物檢測(cè)原始記錄表》及《原料檢驗(yàn)報(bào)告》、《微生物檢測(cè)報(bào)告（去離子水）》、《微生物檢測(cè)報(bào)告（車間空氣）》、《微生物檢測(cè)報(bào)告（包材、容器、個(gè)人衛(wèi)生）》、《微生物培養(yǎng)過(guò)程登記表》《半成品檢測(cè)報(bào)告》、《成品檢測(cè)報(bào)告》、《成品檢測(cè)報(bào)告明細(xì)表》，由品管經(jīng)理審核簽字后存檔，同時(shí)將《成品檢測(cè)報(bào)告明細(xì)表》復(fù)印一份交付工廠留底。對(duì)于不合格的質(zhì)量指標(biāo)產(chǎn)品如實(shí)填寫(xiě)在《品質(zhì)異常聯(lián)絡(luò)單》上，并出具不合格報(bào)告，交給品管經(jīng)理審核并分析不合格原因，采取糾正措施，同時(shí)負(fù)責(zé)跟蹤異常產(chǎn)品的處理進(jìn)度。6.5檢驗(yàn)儀器的使用參照《儀器操作規(guī)范》。6.6相關(guān)事項(xiàng)6.6.1對(duì)新進(jìn)儀器設(shè)備如需進(jìn)行微生物檢驗(yàn)者，由工廠通知微生物檢6.6.2每月6.6.3培養(yǎng)基的配制應(yīng)如實(shí)填寫(xiě)在《培養(yǎng)基配制記錄表7.相關(guān)文件：7.1《微生物細(xì)菌數(shù)量控制標(biāo)準(zhǔn)》7.2《生產(chǎn)車間去離子水檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)》 7.3《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》（2007年版）7.4《化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法》7.5《不合格品控制程序》7.6《儀器操作規(guī)范》廣州大澳化妝品有限公司章節(jié)號(hào)ISO9001：2008之8.編號(hào)WI/DAAO-PG-007A-2011微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)版次A/0頁(yè)碼共25頁(yè)，第7頁(yè)8相關(guān)質(zhì)量記錄表格：記錄名稱記錄編號(hào)責(zé)任部門(mén)保存期限《微生物檢測(cè)原始記錄表》QR/DAAO-PG-G001A-2011品管部三年《微生物檢測(cè)報(bào)告（去離子水）》QR/DAAO-PG-G002A-2011品管部三年半《微生物檢測(cè)報(bào)告（車間空氣）》QR/DAAO-PG-G003A-2011品管部三年半《微生物檢測(cè)報(bào)告（包材、容器、個(gè)人衛(wèi)生）》QR/DAAO-PG-G004A-2011品管部三年半《半成品檢測(cè)報(bào)告》QR/DAAO-PG-A002A-2011品管部三年半《成品檢測(cè)報(bào)告》QR/DAAO-PG-D001A-2011品管部三年半《成品檢測(cè)報(bào)告明細(xì)表》QR/DAAO-PG-D002A-2011品管部三年半《品質(zhì)異常聯(lián)絡(luò)單》QR/DAAO-PG-S001A-2011品管部三年9附件9.1樣品的預(yù)處理9.2細(xì)菌總數(shù)測(cè)定9.3霉菌和酵母菌測(cè)定9.4金黃色葡萄球菌的測(cè)定9.5糞大腸菌群的測(cè)定9.6綠膿桿菌測(cè)定9.7化妝品生產(chǎn)用水的微生物檢驗(yàn)9.8化妝品原料的微生物檢驗(yàn)9.9生產(chǎn)車間空氣的微生物檢測(cè)9.10化妝品生產(chǎn)設(shè)備及環(huán)境物體表面微生物檢驗(yàn)9.11化妝品包材及生產(chǎn)人員個(gè)人衛(wèi)生的微生物檢驗(yàn)廣州大澳化妝品有限公司章節(jié)號(hào)ISO9001：2008之8.2.4編號(hào)WI/DAAO-PG-007A-2011微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)版次A/0頁(yè)碼共25頁(yè)，第8頁(yè)樣品的預(yù)處理化妝品樣品與其他環(huán)境樣品的不同之處，一是化妝品中通常都加有防腐劑；二是化妝品的劑型較多且復(fù)雜。這就給化妝品樣品的預(yù)處理造成了一定的難度。1殘留防腐劑的去除1.1目的由于化妝品中含有防腐劑，使被污染的微生物處于受抑制狀態(tài)，如按常規(guī)的方法制備檢樣進(jìn)行檢驗(yàn)，往往檢不出，甚至出現(xiàn)假陰性。因此必須去除化妝品中多余的防腐劑，使長(zhǎng)期處于瀕死狀態(tài)或半損傷狀態(tài)的微生物得到復(fù)蘇而被檢出，從而得出正確的檢驗(yàn)結(jié)果。1.2去除防腐劑的原則1.2.1.能有效去除化妝品中殘留的防腐劑。1.2.2.對(duì)微生物無(wú)害，不減少微生物的檢出效果。1.2.3.不破壞培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分，不影響其理化性能。1.3去除防腐劑的方法1.3.1化學(xué)中和法又稱中和法，是在供試液或培養(yǎng)基中加入中和劑，將殘留的防腐劑中和掉，使其不再持續(xù)抑制微生物。該方法使用做普遍，也最適用于化妝品中殘留防腐劑的去除。由于防腐劑種類不同，所用的中和劑也應(yīng)不同，但是目前化妝品中常用的防腐劑大多可用卵磷脂和吐溫80中和，故在化妝品衛(wèi)生規(guī)范中檢驗(yàn)化妝品微生物時(shí)采用卵磷脂和吐溫80中和化妝品中殘留的防腐劑。根據(jù)公司產(chǎn)品的類型，此類樣品預(yù)處理方法主要用于油包水的產(chǎn)品。隨著化妝品工業(yè)的迅速發(fā)展，新的防腐劑不斷出現(xiàn)，在化妝品中使用防腐劑的種類也越來(lái)越多，如何選用合格的中和劑，有待進(jìn)一步探討。1.3.2稀釋法主要用于水溶性樣品的稀釋。用稀釋液將樣品稀釋到一定濃度，同時(shí)也降低了殘留防腐劑的濃度，以消除對(duì)微生物的抑制作用。本法的優(yōu)點(diǎn)是任何種類的防腐劑均可應(yīng)用，其缺點(diǎn)是稀釋液過(guò)多，微生物濃度也下降，可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。2供檢樣品的制備2.1.制備原則2.1.1.處理樣品時(shí)應(yīng)嚴(yán)守?zé)o菌操作要求，需在無(wú)菌室或超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行操作。所用試液需滅菌，所用器皿（如三角瓶，吸管，試管，稱量勺，平皿等）也均需滅菌，以免污染樣品，影響檢出結(jié)果。2.1.2.要使樣品充分混合均勻，樣品加到稀釋液中后，要振蕩使之混勻，以免由于染菌的不均勻分布，而影響檢出結(jié)果。2.1.3.盡量做到使樣品完全溶解，在不影響微生物生長(zhǎng)的條件下，可適當(dāng)加溫，加某些對(duì)微生物生長(zhǎng)繁殖不產(chǎn)生影響的助溶劑，使樣品溶解在稀釋液中，其中的微生物分散到供試液中。2.2制備方法在無(wú)菌室的緩沖間內(nèi)打開(kāi)并去掉化妝品的外包裝盒，將樣品送入無(wú)菌操作室，在開(kāi)蓋前將瓶?jī)?nèi)樣品振蕩混勻，消毒瓶蓋和操作人員的手后，再打開(kāi)瓶蓋稱量。不同劑型樣品的取樣和制備方法如下。2.2.1液體樣品水溶性的液體樣品，可量取5ml加到45ml滅菌生理鹽水中，混勻后，制成1：10檢液。油性液體樣品，取5ml樣品，先加入2ml滅菌液體石蠟混勻，再加5ml滅菌的吐溫80，振蕩混勻。加入38ml滅菌生理鹽水，充分混勻，制成1：10檢液廣州大澳化妝品有限公司章節(jié)號(hào)ISO9001：2008之8.2.4編號(hào)WI/DAAO-PG-007A-2011微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)版次A/0頁(yè)碼共25頁(yè)，第9頁(yè)2.2.2膏、霜、乳劑半固體狀樣品親水性的樣品：稱取樣品5g，加到45ml裝有玻璃珠的滅菌生理鹽水中，充分振蕩混勻，靜置15min，取其上清液檢驗(yàn)。疏水性樣品：稱取樣品5g，放到滅菌的研缽中，加5ml滅菌液體石蠟，研磨成粘稠狀，再加入5ml滅菌吐溫80，研磨待溶解后，加入35ml滅菌生理鹽水，充分混勻，制成1：10檢液。2.2.3固體樣品稱取樣品5g，加到45ml滅菌生理鹽水中，充分振蕩混勻，使其分散混懸，靜置后，取上清液檢驗(yàn)。廣州大澳化妝品有限公司章節(jié)號(hào)ISO9001：2008之8.編號(hào)WI/DAAO-PG-007A-2011微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)版次A/0頁(yè)碼共25頁(yè)，第10頁(yè)細(xì)菌總數(shù)測(cè)定細(xì)菌總數(shù)系指1g或1ml1 方法提要化妝品中污染的細(xì)菌種類不同，每種細(xì)菌都有它一定的生理特性，對(duì)營(yíng)養(yǎng)、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、PH值、需氧性質(zhì)有所不同。在實(shí)際工作中，不可能做到滿足所有菌的要求，因此所測(cè)定的結(jié)果，只包括在本方法所使用的條件下（在卵磷脂、吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，于37℃培養(yǎng)48h2培養(yǎng)基和試劑2.1生理鹽水（8.5‰）氯化鈉8去離子水1000ml溶解后，分裝到加玻璃珠的150ml錐形瓶?jī)?nèi)，每瓶45ml或90ml,121℃20min2.2營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基按照試劑說(shuō)明書(shū)上的用法稱取卵磷脂、吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂干粉5.1g加去離子水100ml混合后，加熱溶解，121℃101.5kPa20min高壓滅菌。儲(chǔ)存于微檢室內(nèi)恒溫水浴鍋中（水浴鍋溫度為55℃）2h內(nèi)用完3儀器3.1錐形瓶250ml、150ml3.2量筒3.3高壓消毒鍋3.4試管3.5滅菌平皿：直徑93.6滅菌刻度吸管：10ml、2ml3.7酒精燈3.8恒溫培養(yǎng)箱（37±0.5℃3.9放大鏡4操作步驟4.1用滅菌吸管吸取1：10稀釋的檢樣2ml，分別注入到兩個(gè)滅菌平皿內(nèi)，每皿1ml。另取1ml注入到9ml滅菌生理鹽水中（注意勿使吸管接觸液面），更換一支吸管，并充分混勻，使成1：10稀釋液。吸取2ml，分別注入到兩個(gè)滅菌平皿內(nèi)，每皿1ml。如樣品含菌量高，還可再稀釋成1：1000，1：10000，…..等，每種稀釋度應(yīng)換1支吸管。注意：當(dāng)用吸管從檢樣稀釋液加到另一支裝有9ml空白稀釋液時(shí)，應(yīng)小心沿管壁加入，不要觸及管內(nèi)稀釋液，以防吸管尖端外側(cè)黏附的檢液混入其中。將熔化并冷卻至恢復(fù)到手能觸摸的溫度的營(yíng)養(yǎng)瓊脂傾注平皿內(nèi)，每皿約15ml,另傾注一個(gè)不加樣品的滅菌空平皿，作空白對(duì)照。隨即轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使樣品與培養(yǎng)基充分混廣州大澳化妝品有限公司章節(jié)號(hào)ISO9001：2008之8.2.4編號(hào)WI/DAAO-PG-007A-2011微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)版次A/0頁(yè)碼共25頁(yè)，第11頁(yè)合均勻，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48注意：為防止細(xì)菌增殖及產(chǎn)生片狀菌落，在制成供試液后，應(yīng)盡快稀釋，注皿。一般稀釋后應(yīng)在1h內(nèi)操作完畢。5菌落計(jì)數(shù)方法先用肉眼觀察，點(diǎn)數(shù)菌落數(shù)，然后再用放大5~10倍的放大鏡檢查，以防遺漏。記下各平皿的菌落數(shù)后。求出同一稀釋度各平皿生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)。若平皿中有連成片狀的菌落或花點(diǎn)樣菌落蔓延生長(zhǎng)時(shí)，該平皿不宜計(jì)數(shù)。若片狀菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落數(shù)分布又很均勻，則可將此半個(gè)平皿菌落計(jì)數(shù)后乘2，以代表全皿菌落數(shù)。6菌落計(jì)數(shù)及報(bào)告方法6.1首先選取平均菌落數(shù)在30~300之間的平皿，作為菌落總數(shù)測(cè)定的范圍。當(dāng)只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時(shí)，即以該平皿菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)6.2若有兩個(gè)稀釋度，其平均菌落數(shù)均在30~300個(gè)之間，則應(yīng)求出兩者菌落總之比值來(lái)決定。若其比值小于或等于2，應(yīng)報(bào)告其平均數(shù)，若大于2則報(bào)告其中較小的菌落數(shù)。6.3若所有稀釋的平均菌落數(shù)均大于300個(gè)，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。6.4若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均少于30個(gè)，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)6.5若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30~300個(gè)之間，其中一個(gè)稀釋度大于300個(gè)，而相鄰的另一稀釋度小于30個(gè)時(shí)，則以接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。6.6若所有的稀釋度均無(wú)菌生長(zhǎng)，報(bào)告數(shù)為每克或每毫升小于10個(gè)。6.7菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告，菌落數(shù)在10以內(nèi)時(shí)，按實(shí)有數(shù)值報(bào)告之，大于100時(shí)，采用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，應(yīng)以四舍五入法計(jì)算。為了縮短數(shù)字后面零的個(gè)數(shù)，可用10的指數(shù)來(lái)表示。在報(bào)告菌落數(shù)為“不可計(jì)”時(shí)，應(yīng)注明樣品的稀釋度。廣州環(huán)大澳化妝品有限公司章節(jié)號(hào)ISO9001：2008之8.2.4編號(hào)WI/DAAO-PG-007A-2011微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)版次A/0頁(yè)碼共25頁(yè)，第12頁(yè)霉菌和酵母菌測(cè)定霉菌和酵母菌廣泛存在于自然界中，種類極多，多數(shù)化妝品的PH值、濕度、溫度及儲(chǔ)存條件等皆適合其生長(zhǎng)。國(guó)內(nèi)有資料表明，化妝品受霉菌和酵母菌的污染相當(dāng)嚴(yán)重?；瘖y品被霉菌和酵母菌污染后，不僅使其質(zhì)量下降，而更重要的是有些霉菌和酵母菌及其毒素可使消費(fèi)者致病，危害極大。1方法提要霉菌和酵母菌在虎紅培養(yǎng)基上菌落典型、清晰、易觀察。霉菌菌落具有放射狀或樹(shù)枝狀的菌絲，形成的菌落多數(shù)有各種顏色。酵母菌菌落為圓形隆起，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)，呈不透明乳脂狀，粉紅色，位于培養(yǎng)基深部的菌落可呈鐵餅形、三角形或多角形。2培養(yǎng)基和試劑2.1生理鹽水（8.5‰）氯化鈉8.5g去離子水1000ml溶解后，分裝到加玻璃珠的150ml錐形瓶?jī)?nèi)，每瓶量取45ml,121℃2.2虎紅瓊脂培養(yǎng)基按照試劑說(shuō)明書(shū)上的用法稱取虎紅瓊脂干粉3.16g加100ml去離子水混合后，加熱溶解，121℃101.5kpa20min高壓滅菌。儲(chǔ)存于微檢室內(nèi)恒溫水浴鍋中（水浴鍋溫度為55℃3儀器3.1錐形瓶：250ml、150ml3.2量筒3.3高壓消毒鍋3.4試管3.5滅菌平皿：直徑9cm3.6滅菌刻度吸管：10ml、2ml3.7酒精燈3.8恒溫培養(yǎng)箱（28±0.5℃3.9放大鏡4操作步驟4.1用滅菌吸管吸取1：10稀釋的檢樣2ml，分別注入到兩個(gè)滅菌平皿內(nèi)，每皿1ml。另取1ml注入到9ml滅菌生理鹽水中（注意勿使吸管接觸液面），更換一支吸管，并充分混勻，使成1：10稀釋液。吸取2ml，分別注入到兩個(gè)滅菌平皿內(nèi)，每皿1ml。如樣品含菌量高，還可再稀釋成1：1000，1：10000，…..等，每種稀釋度應(yīng)換1支吸管。注意：由于霉菌孢子多聚積成團(tuán)，故在吸取各稀釋度的供試液時(shí)，需要充分振搖或用吸管反復(fù)吹打，使孢子團(tuán)分散開(kāi)，并均勻混懸。將熔化并冷卻至恢復(fù)到手能觸摸的溫度的虎紅瓊脂傾注平皿內(nèi)，每皿約15ml,另傾注一個(gè)不加樣品的滅菌空平皿，作空白對(duì)照。隨即轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使樣品與培養(yǎng)基充分混合均勻，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置28℃廣州大澳化妝品有限公司章節(jié)號(hào)ISO9001：2008之8.2.4編號(hào)WI/DAAO-PG-007A-2011微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)版次A/0頁(yè)碼共25頁(yè)，第13頁(yè)注意：A:恒溫箱的濕度，一般濕度不低于70%，過(guò)濕霉菌會(huì)大量蔓延生長(zhǎng)，過(guò)干則影響其生長(zhǎng)發(fā)育。B:霉菌在適宜條件下生長(zhǎng)迅速，很快有孢子形成，先成熟的孢子落在培養(yǎng)基上又可萌發(fā)長(zhǎng)成新菌落。因此如在培養(yǎng)中觀察時(shí)，不要反復(fù)翻轉(zhuǎn)平板，以免有次生菌落形成，影響菌落計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。5菌落計(jì)數(shù)方法先用肉眼觀察，點(diǎn)數(shù)菌落數(shù)，然后再用放大5~10倍的放大鏡檢查，以防遺漏。記下各平皿的菌落數(shù)后。求出同一稀釋度各平皿生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)。若平皿中有連成片狀的菌落或花點(diǎn)樣菌落蔓延生長(zhǎng)時(shí)，該平皿不宜計(jì)數(shù)。若片狀菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落數(shù)分布又很均勻，則可將此半個(gè)平皿菌落計(jì)數(shù)后乘2，以代表全皿菌落數(shù)。6菌落計(jì)數(shù)及報(bào)告方法同細(xì)菌總數(shù)相同廣州大澳化妝品有限公司章節(jié)號(hào)ISO9001：2008之8.2.4編號(hào)WI/DAAO-PG-007A-2011微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)版次A/0頁(yè)碼共25頁(yè)，第14頁(yè)金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌在外界分布較廣，抵抗力較強(qiáng)，是人類化膿感染中最常見(jiàn)的病原菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。金黃色葡萄球菌的致病力強(qiáng)弱主要取決于其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶，因此化妝品中檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌有重要意義。1、方法提要典型的金黃色葡萄球菌為球型，直徑0.8μm左右，顯微鏡下排列成葡萄串狀。金黃色葡萄球菌無(wú)芽胞、鞭毛，大多數(shù)無(wú)莢膜，革蘭氏染色陽(yáng)性。金黃色葡萄球菌營(yíng)養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，需氧或兼性厭氧，最適生長(zhǎng)溫度37°C，最適生長(zhǎng)pH7.4。平板上菌落厚、有光澤、圓形凸起，直徑1~2mm。血平板菌落周圍形成透明的溶血環(huán)。金黃色葡萄球菌有高度的耐鹽性，可在10~15%NaCl肉湯中生長(zhǎng)。可分解葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。甲基紅反應(yīng)陽(yáng)性，VP反應(yīng)弱陽(yáng)性。許多菌株可分解精氨酸，水解尿素，還原硝酸鹽，液化明膠。金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抵抗力，對(duì)磺胺類藥物敏感性低，但對(duì)青霉素、紅霉素等高度敏感。2、培養(yǎng)基和試劑2.1生理鹽水（8.5‰）氯化鈉8.5g去離子水1000ml溶解后，分裝到加玻璃珠的150ml錐形瓶?jī)?nèi)，每瓶45ml,121℃101.5kpa20min高壓滅菌。2.2SCDLP培養(yǎng)基按照試劑說(shuō)明書(shū)上的用法量取3.8g的SCDLP干粉加100ml去離子水混合后，加熱溶解，121℃101.5kpa20min高壓滅菌。儲(chǔ)存于微檢室備用。2.3Baird-Parker氏培養(yǎng)基按照試劑說(shuō)明書(shū)上的用法量取5.8gBaird-Parker氏培養(yǎng)基干粉加95ml去離子水混合后，加熱溶解，121℃101.5kpa20min高壓滅菌。儲(chǔ)存于冰箱中備用（存儲(chǔ)時(shí)間不得超過(guò)48h）。3、儀器3.1顯微鏡3.2培養(yǎng)箱3.3水浴鍋3.4滅菌刻度吸管：10ml、2ml3.5滅菌試管3.6載玻片3.7蓋玻片3.8酒精燈3.9接種環(huán)4.0滅菌平皿：直徑9cm4、操作步驟4.1增菌培養(yǎng)本規(guī)范方法用SCDLP增菌液增菌。取1：10稀釋的樣品液5ml接種到45mlSCDLP液體培廣州大澳化妝品有限公司章節(jié)號(hào)ISO9001：2008之8.2.4編號(hào)WI/DAAO-PG-007A-2011微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)版次A/0頁(yè)碼共25頁(yè)，第15頁(yè)養(yǎng)基中，置37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。4.2分離培養(yǎng)自上述增菌培養(yǎng)液中，取1~2接種環(huán)，劃線接種在Baird-Parker氏培養(yǎng)基，如無(wú)此培養(yǎng)基也可劃線接種到血瓊脂平板，置37°C培養(yǎng)24~48h。偶然會(huì)遇到非脂肪溶解的類似菌落，但無(wú)混濁帶及透明帶，挑取單個(gè)菌落分純?cè)谘傊桨迳?，置自上述增菌培養(yǎng)液中，取1~2接種環(huán)，劃線接種在Baird-Parker氏培養(yǎng)基，如無(wú)此培養(yǎng)基也可劃線接種到血瓊脂平板，置37°C培養(yǎng)24h.金黃色葡萄球菌特征見(jiàn)表：培養(yǎng)基菌落特征Baird-Parker瓊脂血瓊脂圓形隆起，光滑，直徑為2~3mm,呈灰色到黑色，邊緣色淡，周圍為一渾濁帶，外層有一透明帶金黃色，圓形隆起，邊緣整齊，外周有透明的溶血環(huán)，直徑為1~2mm,金黃色、4.3、鏡檢染色挑取份純菌落，涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，排列成葡萄狀，無(wú)芽孢，無(wú)莢膜，致病性葡萄球菌，菌落較小，直徑約為0.5～1μm。4.4血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)吸取1：4新鮮血漿0.5ml，放入滅菌的試管中，再加入待檢菌24h肉湯培養(yǎng)物0.5ml。混勻，放37°C恒溫水浴鍋中，每半小時(shí)觀察一次，6檢驗(yàn)報(bào)告按常規(guī)程序檢驗(yàn)，凡分離出革蘭氏陽(yáng)性葡萄球菌的可疑菌落，經(jīng)證實(shí)可發(fā)酵甘露醇、血漿凝固酶陽(yáng)性的菌株，可報(bào)告檢出金黃色葡萄球菌。如果分離的可疑菌落不發(fā)酵甘露醇，血漿凝固酶陽(yáng)性可斷定為檢出金黃色葡萄球菌。如果分離出的可疑菌落不發(fā)酵甘露醇，血漿凝固酶陰性，判斷未檢出金黃色葡萄球菌。廣州大澳化妝品有限公司章節(jié)號(hào)ISO9001：2008之8.2.4編號(hào)WI/DAAO-PG-007A-2011微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)版次A/0頁(yè)碼共25頁(yè)，第16頁(yè)糞大腸菌群的測(cè)定糞大腸菌群是一群需氧及兼性厭氧，在44.5℃培養(yǎng)24~48h能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸并產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。糞大腸菌群不是細(xì)菌分類上的名詞，而是常用的一群衛(wèi)生指示菌。該菌群包括大腸埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、克雷白氏菌屬、腸桿菌屬等。由于糞大腸菌群主要存在于溫血?jiǎng)游锛S便中，隨糞便排出體外，1、方法提要根據(jù)糞大腸菌群所具有的生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定檢驗(yàn)。如該類細(xì)菌為革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌；44.5℃2、培養(yǎng)基和試劑2.1生理鹽水（8.5‰）氯化鈉8.5g去離子水1000ml溶解后，分裝到加玻璃珠的150ml錐形瓶?jī)?nèi)，每瓶量取45ml,121℃101.5kpa20min高壓滅菌。2.2乳糖膽鹽培養(yǎng)基按照試劑說(shuō)明書(shū)上的用法量取6g乳糖膽鹽培養(yǎng)基干粉加去離子水100ml混合后，加熱溶解，121℃101.5kpa20min高壓滅菌。儲(chǔ)存于微檢室備用。2.3伊紅美蘭（EMB）培養(yǎng)基按照試劑說(shuō)明書(shū)上的用法量取3.75g伊紅美蘭培養(yǎng)基干粉加去離子水100ml混合后，加熱溶解，121℃101.5kpa20min高壓滅菌。儲(chǔ)存于冰箱中備用。3、儀器3.1顯微鏡3.2培養(yǎng)箱3.3滅菌刻度吸管：10ml、2ml3.4滅菌試管3.5載玻片3.6蓋玻片3.7接種環(huán)3.8滅菌平皿：直徑9cm3.9酒精燈4、操作步驟4.1增菌培養(yǎng)取10ml1：10稀釋的檢液，加到10ml雙倍濃度的乳糖膽鹽培養(yǎng)基中，置（44.5±0.5）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h，如不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，則報(bào)告為糞大腸菌群陰性。1.產(chǎn)酸產(chǎn)氣，劃線接種到伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置37℃培養(yǎng)18～24h。同時(shí)取該培養(yǎng)液1～２滴接種到蛋白胨水中，置44.5±0.5）℃觀察產(chǎn)酸、產(chǎn)氣時(shí)?？梢?jiàn)到發(fā)酵管內(nèi)有極微量的氣泡，一般情況下，產(chǎn)氣量與糞大腸菌廣州大澳化妝品有限公司章節(jié)號(hào)ISO9001：2008之8.2.4編號(hào)WI/DAAO-PG-007A-2011微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)版次A/0頁(yè)碼共25頁(yè)，第17頁(yè)群的檢出呈正相關(guān)。但產(chǎn)氣泡量小并非糞大腸菌群都是陰性。當(dāng)?shù)构苤杏袠O少量的氣泡或無(wú)氣泡但從液面及壁管可看到緩緩上升的小氣泡時(shí)，均應(yīng)做進(jìn)一步的觀察和鑒別。經(jīng)培養(yǎng)后，在上述平板上觀察有無(wú)典型菌落生長(zhǎng)。糞大腸菌群在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上的典型菌落呈紫黑色，圓形、邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)，常具有金屬光澤。也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤，或粉紫色，中心較深的菌落，也常為糞大腸菌群，應(yīng)注意挑選。2.挑取上述可疑菌落，涂片做革蘭氏染色鏡檢。鏡檢觀察如菌體無(wú)芽孢、呈紅色的革蘭氏陰性短芽孢桿菌時(shí)，繼續(xù)做靛基質(zhì)試驗(yàn)。3.靛基質(zhì)實(shí)驗(yàn)：在蛋白胨水培養(yǎng)液中，加入靛基質(zhì)試劑約0.5ml，觀察靛基質(zhì)反應(yīng)。陽(yáng)性者液面呈現(xiàn)玫瑰紅色，陰性反應(yīng)液面呈試劑本色。檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告按常規(guī)檢驗(yàn)程序，凡發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣在平板上有典型或可疑菌落，并經(jīng)證實(shí)為革蘭氏陰性短桿菌，靛基質(zhì)試驗(yàn)陽(yáng)性，則可報(bào)告每克被檢樣品中檢出糞大腸菌群。廣州大澳化妝品有限公司章節(jié)號(hào)ISO9001：2008之8.2.4編號(hào)WI/DAAO-PG-007A-2011微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)版次A/0頁(yè)碼共25頁(yè)，第18頁(yè)綠膿桿菌培養(yǎng)綠膿桿菌即銅綠色單芽孢菌，也稱綠膿假單胞菌，可產(chǎn)生藍(lán)綠色素和熒光色素。一般情況下該菌不致病，在特殊條件下可引起皮膚化膿感染、泌尿道感染、中耳炎等。外傷及燒傷患者感染后最易引起化膿，并可引起敗血癥?；瘖y品是以涂抹、噴灑或其他類似的方法施于人體表面任何部位以達(dá)到清潔、消除不良?xì)馕?、護(hù)膚、美容和修飾為目的產(chǎn)品。為了保證消費(fèi)者安全，化妝品中不宜檢出綠膿桿菌。1、方法提要根據(jù)綠膿桿菌的生物學(xué)特征，革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陽(yáng)性，能產(chǎn)生綠膿菌素，液化明膠，還原亞硝鹽，在42℃2、培養(yǎng)基和試劑2.1生理鹽水（8.5‰）氯化鈉8.5g去離子水1000ml溶解后，分裝到加玻璃珠的150ml錐形瓶?jī)?nèi)，每瓶量取45ml,121℃101.5kpa20min高壓滅菌。2.2SCDLP培養(yǎng)基按照試劑說(shuō)明書(shū)上的用法量取3.8g的SCDLP培養(yǎng)基干粉加100ml去離子水混合后，加熱溶解，121℃101.5kpa20min高壓滅菌。儲(chǔ)存于微檢室備用。2.3十六烷培養(yǎng)基按照試劑說(shuō)明書(shū)上的用法量取3.33g十六烷培養(yǎng)基干粉加100ml去離子水混合后，加熱溶解，121℃101.5kpa20min高壓滅菌。存儲(chǔ)于冰箱中備用。3、儀器3.1顯微鏡3.2培養(yǎng)箱3.3滅菌刻度吸管：10ml、2ml3.4滅菌試管3.5載玻片3.6蓋玻片3.7接種環(huán)3.8滅菌平皿：直徑9cm3.9酒精燈4、操作步驟4.1增菌培養(yǎng)取1：10樣品稀釋液10ml加到90mlSCDLP液體培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)18h～24h。如有綠膿桿菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)液表面多有如檢驗(yàn)不含防腐劑的產(chǎn)品或原料，可用普通肉湯培養(yǎng)基。4.2分離培養(yǎng)從培養(yǎng)液的薄菌膜處挑取培養(yǎng)物，劃線接種在十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板上，置37℃培養(yǎng)18～24h。凡綠膿桿菌在此培養(yǎng)基上，其菌落扁平無(wú)定型，向周邊擴(kuò)散或略有廣州大澳化妝品有限公司章節(jié)號(hào)ISO9001：2008之8.2.4編號(hào)WI/DAAO-PG-007A-2011微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)版次A/0頁(yè)碼共25頁(yè)，第19頁(yè)表面濕潤(rùn)，菌落呈灰白色，菌落周圍培養(yǎng)基常擴(kuò)散有水溶性色素，此培養(yǎng)基選擇性強(qiáng)，大腸艾希氏菌不能生長(zhǎng)，革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)較差。在缺乏十六烷三甲基溴化銨瓊脂時(shí)也可用乙酰胺培養(yǎng)基進(jìn)行分離，將菌液劃線接種平板上，放在37℃培養(yǎng)24h，綠膿桿菌在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落扁平，邊緣不整，菌落周圍培養(yǎng)基略帶粉紅色，其它4.3染色鏡檢挑取可疑的菌落，涂片，革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性者進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)。檢驗(yàn)報(bào)告被檢樣品經(jīng)增菌分離培養(yǎng)后，經(jīng)證實(shí)為革蘭氏陰性桿菌、氧化酶及綠膿菌素實(shí)驗(yàn)皆為陽(yáng)性者，即可報(bào)告被檢樣品中檢出綠膿桿菌。1.如果分離到的可疑似菌株為革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌，氧化酶實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，不產(chǎn)生綠膿菌素，而能液化明膠，使硝酸鹽還原產(chǎn)氣和42℃生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性時(shí)，仍可報(bào)告被2.符合以下情況之一者，應(yīng)報(bào)告未檢出綠膿桿菌：（1）從增菌液中未分離出任何菌落；（2）分離的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌氧化酶試驗(yàn)陰性；（3）不產(chǎn)生綠膿桿菌色素而氧化酶陰性的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌，經(jīng)試驗(yàn)證明不能液化明膠，硝酸鹽還原產(chǎn)氣和42℃廣州大澳化妝品有限公司章節(jié)號(hào)ISO9001：2008之8.2.4編號(hào)WI/DAAO-PG-007A-2011微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)版次A/0頁(yè)碼共25頁(yè)，第20頁(yè)化妝品生產(chǎn)用水的微生物學(xué)檢驗(yàn)方法水在化妝品中用量極大，是化妝品的主要成分之一，水的品質(zhì)對(duì)化妝品的質(zhì)量有著重大影響。化妝品生產(chǎn)用水的處理方法一般采用過(guò)濾吸附法，點(diǎn)滲析法，離子交換法等，對(duì)生產(chǎn)用水的微生物檢測(cè)指標(biāo)有細(xì)菌總數(shù)，糞大腸桿菌群，霉菌和酵母菌，金黃色葡萄球菌，綠膿桿菌。一、細(xì)菌總數(shù)（參照化妝品細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定方法）菌落總數(shù)是指水樣在一定條件下（營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃，48h1．以無(wú)菌操作方法用滅菌吸管吸取1mL充分混勻的水樣，加到滅菌的平皿內(nèi)，注入約15mL融化并冷卻到45℃2.待冷卻凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，使其底面朝上，置于（37±1）℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，即為1mL水樣中的菌落總數(shù)，以（cfu/mL）報(bào)告結(jié)果。糞大腸桿菌群（參照化妝品糞大腸菌群的測(cè)定方法）糞大腸桿菌群是作為糞便污染指標(biāo)菌提出的，是指一群在44.5℃±0.5℃培養(yǎng)48h能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。糞大腸桿菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對(duì)人體健康潛在危害性的大小，是評(píng)價(jià)化妝品生產(chǎn)用水衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。本公司采用的是乳糖膽鹽培養(yǎng)法1.器具、培養(yǎng)基處理取乳糖膽鹽培養(yǎng)基6g，加入去離子水100ml,攪拌至完全溶解，分裝于帶有小導(dǎo)管的試管中，塞上膠塞，用牛皮紙包扎，與包扎好的平皿，10ml刻度吸管等器材一并放入高壓滅菌鍋中121℃101.5kpa高壓滅菌20min。滅菌后的培養(yǎng)基立即送入微檢室待用，平皿放入烘箱烘干，取出備用。2.操作步驟以無(wú)菌操作方法用滅菌吸管吸取10ml充分混勻的水樣，加到滅菌的10ml雙倍乳糖膽鹽培養(yǎng)基試管內(nèi)，輕輕搖動(dòng)試管，使水樣與培養(yǎng)基充分混勻。置（44.5±0.5）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h。3.報(bào)告方法如不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，則報(bào)告為糞大腸菌群陰性。如產(chǎn)酸產(chǎn)氣再做進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)觀察。霉菌和酵母菌（參照化妝品真菌總數(shù)的測(cè)定方法）霉菌和酵母菌廣泛分布于自然界中，也可存于水中，可引起化妝品變質(zhì)發(fā)霉，有些霉菌還可以產(chǎn)生有毒毒素，所以控制生產(chǎn)用水中的霉菌和酵母菌極為重要。在固體培養(yǎng)基上，霉菌呈放射狀生長(zhǎng)，孢子有各種顏色；酵母菌在培養(yǎng)基表面多呈圓形凸起，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)，在培養(yǎng)基深部生長(zhǎng)的酵母菌多呈鐵餅形，三角形或多角形，在虎紅培養(yǎng)基上是粉紅色。廣州大澳化妝品有限公司章節(jié)號(hào)ISO9001：2008之8.2.4編號(hào)WI/DAAO-PG-007A-2011微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)版次A/0頁(yè)碼共25頁(yè)，第21頁(yè)檢驗(yàn)方法：吸取2mL水樣，分別注入滅菌平皿中，加入融化并冷卻至45℃的虎紅培養(yǎng)基，充分搖勻，凝固后倒置于28℃培養(yǎng)箱中四．綠膿桿菌檢驗(yàn)方法（參照化妝品綠膿桿菌的測(cè)定方法）稱取SCDLP培養(yǎng)基3.8克，加入去離子水100ml，攪拌溶解后分裝到試管中，塞上橡皮塞，用牛皮紙包扎好于121℃101.5kpa高壓滅菌20min。2.把包扎好的平皿、吸管等放入高壓滅菌鍋中121℃101.5kpa3.水樣的稱取以無(wú)菌操作方法用滅菌吸管吸取10mL充分混勻的水樣，加到10mlSCDLP液體培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24h。如有綠膿桿菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)液表面有4.結(jié)果報(bào)告被檢水樣經(jīng)增菌分離培養(yǎng)后，經(jīng)證實(shí)為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶及綠膿桿菌素試驗(yàn)陽(yáng)性，即可報(bào)告被檢水樣每1mL中檢出綠膿桿菌；或綠膿桿菌素試驗(yàn)陰性液化明膠，硝酸鹽還原產(chǎn)氣和42℃生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)三者皆為陽(yáng)性時(shí)，可報(bào)告被檢樣品中檢出綠膿桿菌；反之，可報(bào)告1mL五．金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)方法同上綠膿桿菌檢驗(yàn)方法廣州大澳化妝品有限公司章節(jié)號(hào)ISO9001：2008之8.2.4編號(hào)WI/DAAO-PG-007A-2011微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)版次A/0頁(yè)碼共25頁(yè)，第22頁(yè)化妝品原料的微生物檢驗(yàn)化妝品原料種類很多，性能各異，根據(jù)其性能和用途，大體上可分為基質(zhì)原料和添加劑（輔助原料）?；|(zhì)原料是組成化妝品的主體或在該化妝品內(nèi)起主要功能的手質(zhì)，主要包括油脂、蠟類、粉類、膠質(zhì)類、表面活性劑、防腐劑、抗氧化劑等。添加劑是賦予色、香及其他特定作用的物質(zhì)，大多為天然的含有營(yíng)養(yǎng)成分或生物活性的物質(zhì)，這些成分又是微生物生長(zhǎng)繁殖的良好營(yíng)養(yǎng)源，在一定程度上成為微生物的培養(yǎng)基，因此，檢驗(yàn)原料中的微生物很重要。1、指標(biāo)菌及特定菌的選擇一般原料的微生物指標(biāo)菌同化妝品一樣，即：菌落總數(shù)、糞大腸菌群、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、霉菌和酵母菌。粉類原料大多數(shù)是由土壤礦物質(zhì)加工而成，而土壤受微生物污染嚴(yán)重。據(jù)資料報(bào)道，土壤中的致病菌有需氧的炭疽桿菌和厭氧的破傷風(fēng)桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌等，其檢出率很高，產(chǎn)氣莢膜菌幾乎達(dá)100%，惡性水腫桿菌64%，破傷風(fēng)桿菌29%，肉毒桿菌6%。這些致病菌能在土壤中生存較長(zhǎng)時(shí)間，例如炭疽桿菌的芽孢能生存15年之久；腸道致病菌可生存100~170d；結(jié)核桿菌能生存1年左右；破傷風(fēng)桿菌芽孢和產(chǎn)氣莢膜桿菌也能長(zhǎng)期在土壤中生存。在滑石粉、高嶺土、碳酸鈣等粉類原料中，經(jīng)常檢出枯草桿菌、真菌等，因此，在粉類原料中可增加需氧芽孢桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌和破傷風(fēng)梭菌指標(biāo)。在某些生物性原料如動(dòng)物內(nèi)臟及其提取物等可增加沙門(mén)氏菌指標(biāo)。樣品的預(yù)處理根據(jù)原料性質(zhì)的不同，選用相應(yīng)的預(yù)處理方法，如油質(zhì)類原料可按油性或疏水性（油包水）化妝品處理粉類原料按粉劑化妝品樣品處理等。檢驗(yàn)方法各種微生物的檢驗(yàn)方法均與化妝品成品檢驗(yàn)方法相同，可參見(jiàn)《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》中微生物檢驗(yàn)方法和本指導(dǎo)書(shū)第2篇第3章中所介紹的微生物檢驗(yàn)方法。原料與成品微生物檢驗(yàn)方法最根本的不同點(diǎn)是檢驗(yàn)原料所用的稀釋液和培養(yǎng)基中都不含中和劑（卵磷脂和吐溫-80）。如檢驗(yàn)菌落總數(shù)用普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，綠膿桿菌增菌培養(yǎng)液可用普通肉湯，金黃色葡萄球菌增菌培養(yǎng)液用含7。5%氯化鈉肉湯，稀釋液均用生理鹽水。培養(yǎng)基4.1營(yíng)養(yǎng)瓊脂4.2虎紅瓊脂4.3SCDLP培養(yǎng)基4.4乳糖膽鹽培養(yǎng)基廣州大澳化妝品有限公司章節(jié)號(hào)ISO9001：2008之8.2.4編號(hào)WI/DAAO-PG-007A-2011微生物檢驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)版次A/0頁(yè)碼共25頁(yè)，第23頁(yè)生產(chǎn)車間空氣中的微生物檢測(cè)化妝品生產(chǎn)車間的空氣潔凈度直接關(guān)系到化妝品的質(zhì)量，所以建立常規(guī)的車間空氣質(zhì)量監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，及時(shí)進(jìn)行空氣凈化，可有效保證化妝品達(dá)到衛(wèi)生要求。本公司現(xiàn)采用的是以下檢測(cè)方法：自然沉降法自然沉降法是利用空氣微生物粒子的重力作用，在一定時(shí)間內(nèi)將微生物粒子收集到帶有培養(yǎng)基的平皿內(nèi)，在適宜的溫度下培養(yǎng)生長(zhǎng)成為菌落并進(jìn)行生物學(xué)觀察、計(jì)數(shù)和評(píng)價(jià)。本方法較撞擊法經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便，不需特殊采樣器，但此方法的檢測(cè)結(jié)果受空氣氣流和帶菌顆粒大小的影響較大，所收集的只是一部分較大的微生物粒子。車間空氣檢測(cè)步驟1.根據(jù)待測(cè)空間的大小及通風(fēng)口的位置選擇有代表性的點(diǎn)采樣，通常設(shè)5個(gè)或3個(gè)采樣點(diǎn)，采樣高度為1.2~1.5m,采樣點(diǎn)應(yīng)離墻1m以上,并避開(kāi)空調(diào)、門(mén)窗等空氣流通處。2.將直徑9cm的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板與虎紅瓊脂平板置于采樣點(diǎn)處，打開(kāi)皿蓋，暴露10~30min（根據(jù)空氣的潔凈度）后，蓋上皿蓋，翻轉(zhuǎn)平板，置37℃細(xì)菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h，置28℃3.結(jié)果報(bào)告根據(jù)每