(高清版)DB43∕T 987-2015 辣椒品種純度鑒定SSR分子標(biāo)記法

辣椒品種純度鑒定SSR分子標(biāo)記法2015-01-23發(fā)布2015-03-23實施I前言 Ⅱ 3.1主要儀器設(shè)備 3.2主要試劑 3.3主要耗材 2 24.4銀染、顯影試劑 24.5顯影液 36操作步驟 36.1供試品種樣品制備 3 36.3PCR反應(yīng)體系和程序 36.4變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 6.5染色和顯色 4 附錄A(資料性附錄)部分SSR引物信息 本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/G1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)的某些內(nèi)容可能涉及專利，本標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布機構(gòu)不應(yīng)承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)由湖南省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：湖南省蔬菜研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：鄭井元、劉峰、鄒學(xué)校、張竹青、馬艷青、戴雄澤、李雪峰。1本標(biāo)準(zhǔn)適用于采用SSR分子標(biāo)記法進(jìn)行辣椒品種純度鑒定。2原理簡單重復(fù)序列(Simplesequencerepeats:S研缽、液氮罐、電子天平、恒溫水浴鍋、高速臺式離心機(14000r/min)、紫外分光光度計、高數(shù)碼相機、膠片觀察燈、冰箱(4℃和-20℃)。3.2主要試劑4試劑配制4.1DNA提取試劑4.1.10.5mol/LEDTA(乙二胺四乙酸二鈉鹽)(pH8.0)溶液稱EDTA186.1g,加入已有800mL雙蒸水的燒杯中，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至8.0,補雙蒸水2稱121.1gTris加入含有800mL雙蒸水的燒杯中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至8.0,補雙蒸水定容取160mL三氯甲烷，8mL異戊醇和32mL無水乙醇加在一起混勻，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩７Q取溴酚藍(lán)0.25g,二甲苯青0.25g,加98mL甲酰胺溶液和2mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)溶3后10,000rpm離心5min;將上清仔細(xì)移至另一2mL離心管，加入1倍體積異丙醇，混勻，室溫靜500μL60℃預(yù)熱的雙蒸水，再加入5μLRNaseA(10μg/μL),37℃溫浴10min,最后加入1/10序：94℃5min;94℃30s,58℃30s,72℃30s,35個循環(huán)后72℃延伸5min,擴增完后4℃保46.4.3封膠6.4.5灌膠每個PCR產(chǎn)物中加5μL6×加樣緩沖液，混勻，每個加樣孔加入(3~4)μL樣品。180V恒溫電6.5.1固定6.5.2染色倒掉蒸餾水，加入200mL染色液，在30r/min的水平搖床中，搖10min,倒出染色液，用蒸餾水漂洗2次。6.5.3顯色加400mL顯影液，輕輕搖動，待條帶清晰后，倒掉顯影液，迅速加入固定液定影5min,用蒸餾子純度(Pure:P)的數(shù)值以%表示，按公式(1)計算：5公式中：