細胞融合技術及相關進展

細胞融合技術及相關進展摘要：細胞工程是四大生物工程之一，在生物、醫(yī)學等許多領域取得了開創(chuàng)性的研究成果。細胞融合方法得到不斷更新，融合率也得到逐步提高。該技術在細胞遺傳學、單克隆抗體及種質資源的開發(fā)利用等方面的研究具有重要意義。因此本文對細胞融合的定義機理、應用及融合技術方面的相關研究成果進行總結和闡述。

關鍵詞：細胞融合；生物法；化學法；物理法

細胞融合技術是近30多年來迅速發(fā)展起來的一項新興細胞工程技術，已在農業(yè)、畜牧業(yè)、醫(yī)藥等多領域取得研究成果，且應用領域不斷擴大[1]。細胞融合不僅為細胞的起源、肌肉骨骼胎盤的發(fā)育、干細胞介導的組織再生等理論領域研究提供了有力手段，而且被廣泛應用于育種學、發(fā)生生物學及免疫醫(yī)學，特別是在動植物新品種的培育、單克隆抗體的制備以及抗癌疫苗的研發(fā)等方面具有重要意義。

1細胞融合的定義及機理

細胞融合也稱細胞雜交，是在自然條件下或用人工方法使兩個或兩個以上的同源或異源細胞或原生質體相互接觸，發(fā)生膜融合、胞質融合和核融合而形成雜種細胞的過程。

細胞融合與病毒和細胞之間的融合有許多相似之處，即帶包被的病毒或細胞通過轉膜病毒蛋白介導與宿主細胞的細胞膜進行融合，過程中伴隨蛋白構象的變化。細胞融合主要經過以下幾個主要步驟：原生質體或細胞相互靠近；質膜融合形成細胞橋；胞質滲透；細胞核融合。其中細胞橋的形成是細胞融合的關鍵一步，而只有細胞核發(fā)生了融合，多核細胞才能存活下去。

2細胞融合的方法

2.1生物法

病毒誘導細胞融合：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用而與宿主細胞膜直接融合。當其同時進入兩個細胞時，細胞膜上的蛋白質分子和脂質分子重新排布，打破兩個細胞膜的隔閡，引起細胞質的交流，進而使細胞發(fā)生融合。

單純皰疹病毒（HSV）：HSV介導細胞-細胞融合需要四種關鍵包膜蛋白gD，gB和異二聚體gH/gL，其介導細胞融合的過程如下：gD與細胞受體結合，導致其胞外域的C端部分發(fā)生構象變化，暴露出核心部位[2]；激活的gD與gH/gL相互作用并將其轉化為正調控因子；正調控因子激活gB成為活性的融合因子[3]。最終將導致病毒和宿主細胞膜之間的融合，進而介導細胞-細胞融合。

流感病毒：流感病毒顆粒與宿主細胞表面的唾液酸結合后，通過內吞作用被內化；內含體膜中的蛋白質泵會降低含病毒體的隔室內的pH，而產生兩種效果：由于質子可以通過M2離子通道進入病毒粒子內部，導致粒子內部pH降低，M1層分離，使膜更具延展性并有助于融合[4]；低pH誘導內含體中病毒糖蛋白血凝素的構象變化，導致病毒和細胞膜融合[5]，進而介導細胞-細胞融合。

信號通路介導法：研究發(fā)現MSCs和mESCs可以在共培養(yǎng)中自發(fā)形成融合衍生的雜合體，盡管效率較低。且Rho-Rock-actin/肌球蛋白途徑不僅對MSC分化和ESC自我更新至關重要[6]，對ESC中的細胞融合也是重要的。相反，其抑制作用使MSC皮層張力減少，形成流動性更好的質膜，其促進MSC變形和ESC侵入[7]。研究已經證明不同類型的細胞，包括MSC，神經元細胞，內皮細胞和其他細胞可以通過隧道納米管[8，9]交換囊泡和線粒體等胞質成分。

2.2化學法

化學法是指采用化學誘導劑改變細胞膜脂質分子排列誘導細胞融合的方法。

Janus粒子誘導融合：研究表明，包含氫化、氟化和混合氫化氟化JD的Janus樹枝狀聚合物的三組分體系通過膜水合以特定比例共組合成前所未有的超分子粒子，表示為Janus樹枝狀大分子。它們由啞鈴形結構組成，由洋蔥狀氫化囊泡和洋蔥狀氟化囊泡系在一起。相同三組分體系的不同比例能產生各種結構，包括均勻的洋蔥狀囊泡、核-殼結構和完全自我分選的氫化和氟化囊泡[10]；其自分選途徑可用于穩(wěn)定氫化和氟化雙層之間的界面。裂變樣途徑表明在生物系統(tǒng)中融合和裂變過程可能不需要蛋白質的參與，而是可以由膜組成比率的改變引起[11]。

缺氧誘導融合：研究發(fā)現缺氧促進口腔鱗癌細胞與人永生化口腔上皮細胞之間的自發(fā)性細胞融合。因為低氧可導致上皮-間質轉化（EMT）[12]，其會改變上皮細胞表面的一些蛋白質，蛋白質的變化使上述兩種細胞的融合率增加，而DAPT（EMT阻斷劑）顯著降低融合率[13]。

聚乙二醇（PEG）誘導融合：PEG促細胞融合的機制如下：PEG分子具有弱負極性，可以與具有正極性基團的水分子、蛋白質等形成氫鍵，在相鄰的原生質體間起到分子橋的作用，使原生質體接觸。當其被洗脫時，膜電荷發(fā)生紊亂而重新分配。此時，一種原生質體上帶正電的基團可能與另一個原生質體中帶負電的基團相連，導致原生質體融合。PEG還可以增加類脂膜的流動性，使原生質體的核、細胞器發(fā)生融合成為可能，從而促進細胞融合。此外，研究發(fā)現通過調節(jié)Mg2+濃度至合適區(qū)間可以達到較高的細胞融合率，從而為PEG化學融合提供了一種優(yōu)化方案[14]。

離子誘導融合法：Kuster發(fā)現機械分離的發(fā)生了質壁分離的洋蔥表皮細胞原生質體在NaNO3溶液中可以恢復并伴隨著細胞融合。NaNO3的鈉離子可以中和原生質體表明負電荷，引起原生質體聚集，誘導細胞融合。Keller首先發(fā)現高Ca2+和高pH值可以誘發(fā)細胞融合。鈣離子中和原生質體膜或細胞膜表面電荷，使彼此緊密接觸；高pH能改變質膜的表面電荷，利于細胞融合。

2.3物理法

電脈沖誘導細胞融合技術：指利用電場來誘導細胞彼此連接成串，再施加瞬間強脈沖促使質膜發(fā)生可逆性電擊穿促進細胞融合的技術，是最常用的物理誘導細胞融合的方法。研究發(fā)現，電脈沖誘導的細胞融合的程度受電壓力和滲透力的影響；并且滲透現象在胞吐中是重要的，因此滲透力可以為生物系統(tǒng)中的許多膜融合反應提供驅動力。

激光融合技術：指利用光鑷捕捉并拖動一個細胞使之靠近另一個細胞并緊密接觸，然后對接觸處進行脈沖激光束處理，使質膜發(fā)生光擊穿，產生微米級的微孔。這樣由于質膜上微孔的可逆性，細胞開始變形融合，最終成為一個細胞。QuetF.Ahkong等人[15]采用激光誘導單細胞融合技術，成功制備融合肝細胞癌細胞和干細胞基因表達信息的融合細胞系。

空間細胞融合技術：由于地球引力的存在，有液泡的原生質體與無液泡的原生質體的密度差很大，異源細胞間的融合得率十分有限。在利用動物細胞融合生產單克隆抗體過程中，在地面上由于無法排除地球引力的影響，要提高細胞融合得率相當困難。上世紀80年代以來，人們在空間材料科學的啟發(fā)下，試圖利用空間微重力條件改進細胞融合技術。大量的飛行實驗結果表明，在微重力條件下酵母細胞的融合得率有很大的增加，原因主要是降低了重力沉降影響，而雜種細胞的活力增加可能是由細胞排列時間縮短引起的。

離子束細胞融合技術：離子束細胞融合技術原理如下：采用微束對細胞進行超微加工，有目的地切割染色體，通過消除部分染色體或染色體的某些片段達到細胞非對稱融合[16]；在離子束與細胞相互作用中，粒子的植入、動量的傳遞和電荷交換可導致細胞表面被刻蝕，引起細胞膜透性和跨膜電場的改變，進而實現細胞融合[17]。

非對稱細胞融合技術：指利用某種外界因素輻照某一細胞原生質體，選擇性地破壞其細胞核，并用碘乙酰胺堿性蕊香紅6G處理在細胞核中含有優(yōu)良基因的第二種原生質體，選擇性地使其細胞質失活。然后融合來自這兩個原生質體品系的細胞，從而實現所需胞質和細胞核基因的優(yōu)化組合；或使前者被打碎的細胞核染色體片段中的個別基因滲入到后者原生質體的染色體內，實現有限基因的轉移，從而在保留親本全部優(yōu)良性狀的同時改良其某個不良性狀。

2.4物理-化學結合法

植物血凝素-ECM830細胞融合法：植物血凝素是一種有絲分裂原，可以起到細胞凝聚的作用，使得兩細胞膜緊密接觸。MIRui-fang等人[18]證實在植物血凝素作用的基礎上進行ECM830電擊融合，可以大大提高細胞融合效率。

3細胞融合的應用

3.1動物細胞融合技術的應用

用于研究細胞的核質關系、揭示疾病發(fā)生的機制、基因定位、衰老機制、動物育種、生產單克隆抗體、細胞療法等。如以聚乙二醇作為介導，將小白鼠骨髓的瘤細胞和進行綿羊紅細胞免疫處理的小白鼠B淋巴細胞進行細胞融合，從而形成單克隆抗體技術[19]。

3.2植物細胞融合技術的應用

改善作物品質、培育抗逆植株、種質保存和有用物質生產、無性系的快速繁殖和植物疾病防治等。如用細胞融合技術將球形芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌進行融合，培養(yǎng)出具有滅蚊和滅螟能力的新菌株[19]。

3.3微生物細胞融合技術的應用

用于生物藥品的生產，包括抗生素、生物活性物質、疫苗等；如細胞融合棘孢小單孢菌和灰色鏈霉菌素，相比于親本菌，融合子產慶大霉素的產量明顯得到提高[19]。還為發(fā)酵工業(yè)提供優(yōu)良菌種，如釀酒酵母和糖化酵母的種間雜交，分離子后代中個別菌株具有糖化和發(fā)酵的雙重能力。

結語

細胞融合技術在生物、醫(yī)藥等多個領域有巨大的潛在應用價值，其發(fā)展前景非常廣闊。因此，來自物理、生物、醫(yī)學等領域的各國科學家相繼在該領域傾注了大量人力物力進行專項研究。毫無疑問，它將成為21世紀的新興產業(yè)，定能為人類帶來福音。

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