液體菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程第7部分：羊肚菌

5生產(chǎn)技術(shù)液體菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程第7部分：羊肚菌本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了羊肚菌液體菌種生產(chǎn)基本要求、生產(chǎn)技術(shù)、工藝流程、液體菌種質(zhì)量指標(biāo)、貯藏、記錄及生產(chǎn)檔案等技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于羊肚菌液體菌種生產(chǎn)。2.規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB150.1壓力容器第1部分：通用要求GB4789.28食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求GB5749食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB50073潔凈廠房設(shè)計規(guī)范GB/T12728食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食用菌術(shù)語NY/T528食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程NY/T1846食用菌菌種檢驗規(guī)程NY/T1731食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食用菌菌種良好作業(yè)規(guī)范3.術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4.生產(chǎn)基本要求4.1工作人員具有食用菌菌種生產(chǎn)能力的專業(yè)技術(shù)人員和檢驗人員。4.2場地生產(chǎn)場所應(yīng)符合NY/T528的規(guī)定。環(huán)境衛(wèi)生應(yīng)符合NY/T1731的規(guī)定。4.3廠房廠房設(shè)計應(yīng)符合NY/T528的規(guī)定。4.4生產(chǎn)設(shè)施與設(shè)備要求設(shè)備與設(shè)施應(yīng)符合NY/T528的規(guī)定。液體種發(fā)酵罐質(zhì)量應(yīng)符合GB150.1的規(guī)定。4.5培養(yǎng)原料培養(yǎng)基原料應(yīng)符合NY/T528的規(guī)定。生產(chǎn)用水標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)符合GB5749要求。4.6生產(chǎn)品種選用高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強、商品性好的羊肚菌品種，從具相應(yīng)資質(zhì)的供種單位引種或本單位選育，并清楚地追溯菌種來源。菌種生產(chǎn)過程應(yīng)符合NY/T528的要求。51工藝流程圖1羊肚菌液體菌種工藝流程5.2母種制備5.2.1培養(yǎng)基配方馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨4g/L,磷酸二氫鉀3g/L，硫酸鎂1.5g/L，瓊脂20g/L，pH自然。5.2.2母種活化母種活化操作流程應(yīng)符合NY/T528要求。將保存的初始菌種切割成直徑4～6mm的菌絲塊，接種到培養(yǎng)基中，18～20℃避光恒溫培養(yǎng)4～6d，菌絲長滿試管或者培養(yǎng)皿檢驗合格即可使用。5.2.3母種質(zhì)量檢查培養(yǎng)期間每天檢查菌體生長情況，及時淘汰染菌或劣勢菌種。菌絲長滿管后按照NY/T1846規(guī)程進(jìn)行檢驗，合格菌種進(jìn)入生產(chǎn)流程。5.3搖瓶液體菌種制備5.3.1容器使用無色專用玻璃菌種甁，可用棉塞、硅膠塞、專用封口透氣膜封口。5.3.2培養(yǎng)基配方馬鈴薯200g/L,葡萄糖20g/L,蛋白胨4g/L,磷酸二氫鉀3g/L,硫酸鎂1.5g/L,pH5.3.3培養(yǎng)基配制按液體培養(yǎng)基配方配制，混合均勻，裝入搖瓶中，裝液量為搖甁容量的50～60%，加入0.01%消泡劑，搖瓶中放置磁力攪拌棒，封口。5.3.4滅菌將分裝好的搖瓶放入高壓滅菌鍋內(nèi)進(jìn)行滅菌，滅菌蒸汽壓力升至0.11～0.13MPa，恒壓維持25～30min。5.3.5接種待培養(yǎng)基冷卻至25℃以下，在無菌條件下，用打孔器打孔（5mm孔徑）或接種鉤?。?mm×5mm）的4塊活化母種塊迅速轉(zhuǎn)接于搖甁培養(yǎng)基內(nèi)，封口。5.3.6培養(yǎng)搖瓶接種后移至恒溫?fù)u床中，培養(yǎng)溫度18～20℃,轉(zhuǎn)速150r/min，避光培養(yǎng)4～6d。5.3.7搖瓶液體菌種質(zhì)量要求菌液澄清透明，菌絲體分布均勻，無異味；鏡檢無雜菌、菌絲形態(tài)正常。5.4發(fā)酵罐液體菌種制備5.4.1發(fā)酵罐空消發(fā)酵罐初次使用、出現(xiàn)雜菌、長期放置及更換品種時，應(yīng)進(jìn)行空消滅菌。蒸氣壓力0.11~0.14MPa、恒壓維持40min。5.4.2培養(yǎng)基配方宜選用以下配方，且培養(yǎng)基質(zhì)應(yīng)符合NY/T528要求。馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨4g/L，磷酸二氫鉀3g/L，硫酸鎂1.5g/L,pH5.4.3投料與定容將原料、水按比例攪拌均勻，加入罐內(nèi)，裝液量為罐體容量的70～80%，加入0.01%消泡劑，擰緊上料口蓋。5.4.4發(fā)酵罐實消液體種發(fā)酵罐內(nèi)蒸汽壓力控制在0.11～0.12MPa，恒壓維持60～90min。5.4.5冷卻滅菌結(jié)束，關(guān)閉空氣過濾器滅菌閥與排氣閥，緩慢打開夾套排氣閥降壓至0MPa，通入冷水降溫；同時緩慢打開發(fā)酵罐罐內(nèi)排氣閥降壓，待壓力接近0.02～0.04MPa時向罐內(nèi)通入無菌空氣，調(diào)整排氣閥，維持罐壓0.04～0.05MPa，培養(yǎng)液溫度降至25℃以下時，關(guān)閉夾套進(jìn)水閥。5.4.6接種將搖瓶接種管和發(fā)酵罐接種口用75%酒精消毒，用95%酒精的火焰圈套在接種口上，輕微打開閥門，使發(fā)酵罐罐內(nèi)壓力為0.01MPa。點燃火焰圈，在火焰保護(hù)下用鑷子去掉瓶塞，打開接種口閥門，將搖瓶菌種注入發(fā)酵罐。接種量為0.5～1.0%。接種后迅速關(guān)閉接種閥門，去掉火焰圈，繼續(xù)通入無菌空氣。5.4.7發(fā)酵培養(yǎng)根據(jù)菌絲生長情況，適時調(diào)節(jié)進(jìn)氣閥門，通入適量無菌空氣，通氣量一般為1：0.8V/V?min～1：1V/V?min，同時調(diào)節(jié)排氣閥，維持罐壓0.01～0.02MPa，培養(yǎng)溫度控制在20～22℃,培養(yǎng)4～6d。5.4.8檢測發(fā)酵后第4d開始定期檢測，采用顯微鏡和感官觀察菌絲生長狀況以及有無雜菌污染。6液體菌種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)6.1感官要求應(yīng)符合表1的規(guī)定。表1羊肚菌液體菌種感官要求項目感官指標(biāo)菌液色澤菌液澄清，呈淡黃色，菌絲球呈白色菌液形態(tài)菌液粘稠不分層，菌絲體分布均勻。菌液氣味有羊肚菌液體培養(yǎng)時特有的香氣，無異味，搖瓶氣味正常，發(fā)酵罐排氣口氣味正常6.2理化指標(biāo)應(yīng)符合表2的規(guī)定。表2羊肚菌液體菌種理化指標(biāo)項目理化指標(biāo)pH值4.5～5.5菌絲濕重（mg/mL）菌絲球直徑（cm）<0.45顯微鏡下菌絲形態(tài)菌絲著色深，均勻、粗壯、分支呈樹枝狀雜菌鑒別無霉菌、酵母和細(xì)菌菌體6.3液體菌種檢測6.3.1形態(tài)學(xué)觀察通過肉眼觀察菌絲球形態(tài)，通過顯微鏡觀察菌絲體形態(tài)。6.3.2霉菌檢驗按照無菌操作從取樣閥取少量培養(yǎng)液，接種于GB4789.28中規(guī)定的PDA培養(yǎng)基中，25~30℃恒溫培養(yǎng)48～72h，采用顯微鏡和感官觀察菌絲生長狀況和有無霉菌污染，必要時進(jìn)行水封片鏡檢。6.3.3細(xì)菌檢驗按照無菌操作從取樣閥取少量培養(yǎng)液，接種于GB4789.28中規(guī)定的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中，30～35℃恒溫培養(yǎng)24～48h，觀察是否有細(xì)菌污染,必要時進(jìn)行鏡檢和劃線培養(yǎng)檢驗。6.3.4pH測定用pH計測定菌液酸堿度。6.3.5菌絲濕重測定稱取一定體積的培養(yǎng)液，經(jīng)10000r/min離心5min，稱重。6.3.6菌絲球直徑隨機吸取1mL培養(yǎng)液，將其中的菌絲球排列成直線，查出菌球數(shù)量，用刻度尺測其總長度，計算每個菌絲球的平均直徑。7.1標(biāo)簽生產(chǎn)的菌種必須貼有質(zhì)量合格標(biāo)簽，其內(nèi)容包含菌種種類、級別、品種、生產(chǎn)單位、接種7.2貯存條件7.2.1母種保存母種在0～4℃條件下貯存，貯存期不超過60d。7.2.2搖瓶菌種保存搖瓶菌種如不能立即使用，需降溫保存。4℃、暗光條件下可保存5～7d。7.2.3發(fā)酵罐液體菌種保存