顯微技術(shù)及電子顯微鏡課件

2顯微技術(shù)和顯微鏡顯微技術(shù)及電子顯微鏡2顯微技術(shù)和顯微鏡主要內(nèi)容電子顯微鏡透射電子顯微鏡的結(jié)構(gòu)及原理掃描電子顯微鏡的結(jié)構(gòu)及原理掃描隧道顯微鏡的結(jié)構(gòu)及原理2顯微技術(shù)和顯微鏡顯微鏡的發(fā)展光學(xué)顯微鏡（17世紀）電子顯微鏡（1932年，1952年）掃描隧道顯微鏡（1981年）2顯微技術(shù)和顯微鏡光學(xué)顯微鏡的原理2顯微技術(shù)和顯微鏡光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)①機械部分：鏡座、鏡柱、鏡臂、鏡筒、調(diào)焦裝置、載物臺（物鏡轉(zhuǎn)換器）②光學(xué)部分：目鏡、物鏡、反光鏡、聚光鏡放大倍數(shù)：目鏡的放大倍數(shù)×物鏡的放大倍數(shù)2顯微技術(shù)和顯微鏡顯微鏡的基本概念分辨率：能夠把兩個點分辨開的最小距離。放大倍數(shù)：顯微鏡經(jīng)多次成像后最終所成像的大小相對原來物體大小的比值。有效放大：對于某一顯微鏡來說，在其分辨能力之內(nèi)的圖像放大。此時的圖像放大不失圖像表面的細節(jié)。無效放大：在顯微鏡分辨能力以外的圖像放大。只是放大了圖像輪廓，不能放大和分辨圖像的表面細節(jié)。2顯微技術(shù)和顯微鏡景深：又稱焦點深度，指在要求成一副清晰像的前提下，像平面不變，景物沿光軸前后移動的距離。焦長：景物不動，像平面沿光軸前后移動的距離。2顯微技術(shù)和顯微鏡電子顯微鏡2顯微技術(shù)和顯微鏡

射線x射線紫外光紅外光微波無線電波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可見光2顯微技術(shù)和顯微鏡加速電壓與電子波長加速電壓（kV）電子波長（A）加速電壓（kV）電子波長（A）

250.0762000.025500.0545000.014750.04310000.00871000.03730000.0036加速電壓一般在50-100kv之間2顯微技術(shù)和顯微鏡電子顯微鏡（EM）1932年，德國科學(xué)家Maxknoll和ErnstRusha制成了世界上第一臺透射電子顯微鏡（transmissionelectronmicroscope,TEM).1952年，英國工程師charlesOatley制造了第一臺掃描電子顯微鏡(scanningelectronmicroscope,SEM).2顯微技術(shù)和顯微鏡入射電子束吸收電子二次電子背散射電子俄歇電子特征X射線透射電子透射電子（包含非彈性散射電子）（彈性散射電子）樣品入射電子與樣品相互作用后，使樣品原子較外層電子（價帶或?qū)щ婋娮樱╇婋x產(chǎn)生的電子。僅在表面深度5nm-10nm時逸出2顯微技術(shù)和顯微鏡TEM的工作原理原理：與光學(xué)顯微鏡相似，不同的是透射電子顯微鏡用電子束作為光源，用電磁場作透鏡。電子束投射到樣品時，可隨組織構(gòu)成成分的密度不同而發(fā)生相應(yīng)的電子散射，如電子束投射到質(zhì)量大的結(jié)構(gòu)時，電子被散射的多，因此投射到熒光屏上的電子少而呈暗像，電子照片上則呈黑色，稱電子密度高。反之，則稱為電子密度低。2顯微技術(shù)和顯微鏡中性粒細胞（透射電鏡）黑白反差結(jié)構(gòu)影像影像較黑稱電子密度高反之稱電子密度低2顯微技術(shù)和顯微鏡

ＴＥＭ的結(jié)構(gòu)照明系統(tǒng)成像系統(tǒng)真空系統(tǒng)供電系統(tǒng)機械系統(tǒng)觀察顯示系統(tǒng)電子槍聚光鏡物鏡中間鏡投影鏡2顯微技術(shù)和顯微鏡1.照明系統(tǒng)照明系統(tǒng)主要由電子槍和聚光鏡組成。電子槍是發(fā)射電子的照明光源。聚光鏡是把電子槍發(fā)射出來的電子會聚而成的交叉點進一步會聚后照射到樣品上。照明系統(tǒng)的作用就是提供一束亮度高、照明孔徑角小、平行度好、束流穩(wěn)定的照明源。2顯微技術(shù)和顯微鏡電子槍的結(jié)構(gòu)及工作原理圖電子槍是電鏡的電子發(fā)射源，其作用是形成電子束，并控制電子束的發(fā)射，獲得一高亮度和高穩(wěn)定度的照明電子光源由陰極燈絲發(fā)射的電子，通過柵極上的小孔和電子槍交叉點，即電鏡的實際電子源。形成射線電子束，經(jīng)高電壓加速后成為高速電子流奔向聚光鏡。電子束在電子槍中是逐級加速的2顯微技術(shù)和顯微鏡1）陰極又稱燈絲，一般由0.08~0.18mm鎢絲作成V或Y形狀。2顯微技術(shù)和顯微鏡2）控制極：調(diào)節(jié)電子的初速度、控制電子束流大小及形狀，工作電壓比燈絲負100～500V。改變其電位可改變控制電子束的形狀和發(fā)射強度。3）陽極：加速從陰極發(fā)射出的電子。一般接地。陽極與柵極為互相背相的兩個圓形筒，中間有一個小圓孔，均用不銹鋼加工制成。2顯微技術(shù)和顯微鏡聚光鏡由于電子之間的斥力和陽極小孔的發(fā)散作用，電子束穿過陽極后，逐漸變粗，射到試樣上仍然過大。聚光鏡有增強電子束密度和再次將發(fā)散的電子會聚起來的作用。多為磁透鏡，調(diào)節(jié)其電流控制照明光斑的大小，使在不同的放大倍數(shù)下只照明樣品的被觀察部分，減少樣品不必要的加熱和污染。2顯微技術(shù)和顯微鏡一般裝置雙聚光鏡，第一聚光鏡為一強透鏡，可把電子槍交叉點縮小到1um左右，第二聚光鏡為一弱透鏡，可以把縮小的光斑放大到數(shù)微米并聚焦到樣品上2顯微技術(shù)和顯微鏡電磁透鏡的結(jié)構(gòu)電子源電子軌跡銅導(dǎo)線軟鐵殼軟鐵殼焦點2顯微技術(shù)和顯微鏡2.成像系統(tǒng)由電子透鏡組成，是能使電子束聚焦的裝置。電子透鏡是電鏡的核心部件，其工作方式是利用復(fù)雜的電極和線圈結(jié)構(gòu)形成靜電場和磁場。電子透鏡存在各種像差（aberration），這是影響成像質(zhì)量的主要因素。電子透鏡根據(jù)其作用又分為物鏡、中間鏡和投影鏡。2顯微技術(shù)和顯微鏡2顯微技術(shù)和顯微鏡（1）物鏡成一次像。決定透射電鏡的分辨本領(lǐng)，要求它有盡可能高的分辨本領(lǐng)、足夠高的放大倍數(shù)和盡可能小的像差。通常采用強激磁，短焦距的物鏡。放大倍數(shù)較高，一般為100～300倍。目前高質(zhì)量物鏡分辨率可達0.1nm左右2顯微技術(shù)和顯微鏡（2）中間鏡成二次像。弱激磁的長焦距變倍透鏡，0～20倍可調(diào)。（3）投影鏡短焦距強磁透鏡，最后一級放大像，最終顯示到熒光屏上，稱為三級放大成像。2顯微技術(shù)和顯微鏡電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的光路比較2顯微技術(shù)和顯微鏡3.真空系統(tǒng)由機械泵、油擴散泵或離子泵、聯(lián)動控制閥門、真空排氣管道、空氣過濾器和用于真空度指示的真空測量規(guī)等組成。2顯微技術(shù)和顯微鏡4.供電系統(tǒng)透射電鏡需要兩部分電源：一是供給電子槍的高壓部分，二是供給電磁透鏡的低壓穩(wěn)流部分。電源的穩(wěn)定性是電鏡性能好壞的一個極為重要的標志。所以，對供電系統(tǒng)的主要要求是產(chǎn)生高穩(wěn)定的加速電壓和各透鏡的激磁電流。近代儀器除了上述電源部分外，尚有自動操作程序控制系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理的計算機系統(tǒng)。2顯微技術(shù)和顯微鏡5.機械系統(tǒng)包括電鏡座、標本室、磁屏蔽外殼、鏡筒、制冷系統(tǒng)和控制臺等。由于電子易散射或被物體吸收，故穿透力低，必須制備更薄的超薄切片（通常為50～100nm）。2顯微技術(shù)和顯微鏡主要包括取材、固定、包埋、切片、染色等步驟超薄切片技術(shù)厚度：50～100nm1mm32顯微技術(shù)和顯微鏡6.觀察記錄系統(tǒng)人眼無法觀測電子，TEM中的電子信息通過熒光屏和照相底版轉(zhuǎn)換為可觀察圖像。2顯微技術(shù)和顯微鏡硅的晶格排布2顯微技術(shù)和顯微鏡應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)中主要用于觀察組織和細胞內(nèi)的亞顯維結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)、核酸等大分子的形態(tài)結(jié)構(gòu)及病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)。是區(qū)別細胞凋亡與細胞壞死的最可靠的辦法。2顯微技術(shù)和顯微鏡掃描電子顯微鏡(SEM)2顯微技術(shù)和顯微鏡一、SEM的成像原理電子槍發(fā)出電子束電磁透鏡聚焦形成電子探針激發(fā)樣品產(chǎn)生二次電子偏轉(zhuǎn)線圈使得電子束在樣品表面逐點逐行掃描二次電子探測器將電子信號轉(zhuǎn)變成為光信號光電倍增管形成二次電子脈沖信號視頻放大器形成電壓模擬信號在熒光屏顯示圖像或轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號輸入計算機2顯微技術(shù)和顯微鏡2顯微技術(shù)和顯微鏡光鏡、透射電鏡和掃描電鏡的工作原理圖2顯微技術(shù)和顯微鏡二次電子探測器的工作原理圖2顯微技術(shù)和顯微鏡SEM電磁透鏡HITACHI

ModelS-3000N樣品臺操作系統(tǒng)CRT電子槍電子探頭

樣品室2顯微技術(shù)和顯微鏡電子光學(xué)系統(tǒng)：電子槍、電磁透鏡信號檢測系統(tǒng)：二次電子探測器、光電倍增管圖像顯示和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：CRT掃描系統(tǒng)：偏轉(zhuǎn)線圈、掃描波發(fā)生器真空系統(tǒng)：機械泵、油擴散泵、閥門等電源：高壓電源、真空系統(tǒng)電源等SEM的基本結(jié)構(gòu)2顯微技術(shù)和顯微鏡掃描系統(tǒng)掃描偏轉(zhuǎn)線圈（電子束偏轉(zhuǎn)器）—

隨電流波形而產(chǎn)生變化磁場，推動電子束偏轉(zhuǎn)移動，使電子探針在樣品上以一定的方式和速度移動掃描信號發(fā)生器—

產(chǎn)生掃描脈沖信號，同步提供給鏡體和顯示器中的掃描線圈2顯微技術(shù)和顯微鏡SEM的應(yīng)用主要用來觀查組織、細胞表面或斷裂面的超微結(jié)構(gòu)及較大的顆粒性樣品的表面形態(tài)結(jié)構(gòu)2顯微技術(shù)和顯微鏡SEMTEM

最高分辨率3～10nm0.1~0.3nm放大率7～200,000100~800,000加速電壓1~30kv20~200kv成像原理二次電子透射電子樣品大小10mm2×5mm1mm3

觀察對象表面形貌內(nèi)部結(jié)構(gòu)制樣方法較易復(fù)雜操作維護方便復(fù)雜SEM與TEM的比較2顯微技術(shù)和顯微鏡掃描電鏡照片展示注射針頭的掃描電鏡照片2顯微技術(shù)和顯微鏡掃描電鏡照片展示紅血球可以用計算機將黑白照片處理成彩色2顯微技術(shù)和顯微鏡放大倍率范圍廣掃描電鏡特點立體感強2顯微技術(shù)和顯微鏡掃描隧道顯微鏡（STM）2顯微技術(shù)和顯微鏡

量子理論中的隧道效應(yīng)極細探針與研究物質(zhì)作為兩個極隧道電流STM的工作原理2顯微技術(shù)和顯微鏡STM的工作原理利用量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)，在樣品與探針之間加一定（1V左右）的電壓，當樣品與針尖距離非常接近（小于1nm）時，樣品和針尖之間將產(chǎn)生隧道電流隧道電流的大小和兩極之間的距離呈指數(shù)關(guān)系2顯微技術(shù)和顯微鏡STM的基本裝置工作過程：利用探針針尖掃描樣品，通過隧道電流獲取信息，經(jīng)計算機處理得到圖象。2顯微技術(shù)和顯微鏡STM探針：金屬絲經(jīng)化學(xué)腐蝕，在腐蝕斷裂瞬間切斷電流，獲得尖峰，曲率半徑為10nm左右。STM

針尖STM的基本裝置2顯微技術(shù)和顯微鏡掃描器檢測電路輸出樣品運動軌跡STM的掃描模式特點：掃描速度快，噪音減少，但不能用于觀察表面起伏大于1nm的樣品。（1）恒高測量模式：探針以不變高度在樣品表面掃描，隧道電流隨試件表面起伏而變化，從而得到樣品表面形貌信息。2顯微技術(shù)和顯微鏡STM的掃描模式樣品輸出運動軌跡驅(qū)動電路掃描器檢測電路控制器（2）恒電流測量模式：探針在樣品表面掃描，使用反饋電路驅(qū)動探針，使探針與樣品表面之間距離（隧道間隙）不變。此時探針移動直接描繪了樣品表面形貌。特點：此種測量模式隧道電流對隧道間隙的敏感性轉(zhuǎn)移到反饋電路驅(qū)動電壓與位移之間的關(guān)系上，避免了非線性