顯微技術(shù)及電子顯微鏡課件

2顯微技術(shù)和顯微鏡顯微技術(shù)及電子顯微鏡2顯微技術(shù)和顯微鏡主要內(nèi)容電子顯微鏡透射電子顯微鏡的結(jié)構(gòu)及原理掃描電子顯微鏡的結(jié)構(gòu)及原理掃描隧道顯微鏡的結(jié)構(gòu)及原理2顯微技術(shù)和顯微鏡顯微鏡的發(fā)展光學(xué)顯微鏡（17世紀(jì)）電子顯微鏡（1932年，1952年）掃描隧道顯微鏡（1981年）2顯微技術(shù)和顯微鏡光學(xué)顯微鏡的原理2顯微技術(shù)和顯微鏡光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)①機(jī)械部分：鏡座、鏡柱、鏡臂、鏡筒、調(diào)焦裝置、載物臺(tái)（物鏡轉(zhuǎn)換器）②光學(xué)部分：目鏡、物鏡、反光鏡、聚光鏡放大倍數(shù)：目鏡的放大倍數(shù)×物鏡的放大倍數(shù)2顯微技術(shù)和顯微鏡顯微鏡的基本概念分辨率：能夠把兩個(gè)點(diǎn)分辨開(kāi)的最小距離。放大倍數(shù)：顯微鏡經(jīng)多次成像后最終所成像的大小相對(duì)原來(lái)物體大小的比值。有效放大：對(duì)于某一顯微鏡來(lái)說(shuō)，在其分辨能力之內(nèi)的圖像放大。此時(shí)的圖像放大不失圖像表面的細(xì)節(jié)。無(wú)效放大：在顯微鏡分辨能力以外的圖像放大。只是放大了圖像輪廓，不能放大和分辨圖像的表面細(xì)節(jié)。2顯微技術(shù)和顯微鏡景深：又稱(chēng)焦點(diǎn)深度，指在要求成一副清晰像的前提下，像平面不變，景物沿光軸前后移動(dòng)的距離。焦長(zhǎng)：景物不動(dòng)，像平面沿光軸前后移動(dòng)的距離。2顯微技術(shù)和顯微鏡電子顯微鏡2顯微技術(shù)和顯微鏡

射線x射線紫外光紅外光微波無(wú)線電波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可見(jiàn)光2顯微技術(shù)和顯微鏡加速電壓與電子波長(zhǎng)加速電壓（kV）電子波長(zhǎng)（A）加速電壓（kV）電子波長(zhǎng)（A）

250.0762000.025500.0545000.014750.04310000.00871000.03730000.0036加速電壓一般在50-100kv之間2顯微技術(shù)和顯微鏡電子顯微鏡（EM）1932年，德國(guó)科學(xué)家Maxknoll和ErnstRusha制成了世界上第一臺(tái)透射電子顯微鏡（transmissionelectronmicroscope,TEM).1952年，英國(guó)工程師charlesOatley制造了第一臺(tái)掃描電子顯微鏡(scanningelectronmicroscope,SEM).2顯微技術(shù)和顯微鏡入射電子束吸收電子二次電子背散射電子俄歇電子特征X射線透射電子透射電子（包含非彈性散射電子）（彈性散射電子）樣品入射電子與樣品相互作用后，使樣品原子較外層電子（價(jià)帶或?qū)щ婋娮樱╇婋x產(chǎn)生的電子。僅在表面深度5nm-10nm時(shí)逸出2顯微技術(shù)和顯微鏡TEM的工作原理原理：與光學(xué)顯微鏡相似，不同的是透射電子顯微鏡用電子束作為光源，用電磁場(chǎng)作透鏡。電子束投射到樣品時(shí)，可隨組織構(gòu)成成分的密度不同而發(fā)生相應(yīng)的電子散射，如電子束投射到質(zhì)量大的結(jié)構(gòu)時(shí)，電子被散射的多，因此投射到熒光屏上的電子少而呈暗像，電子照片上則呈黑色，稱(chēng)電子密度高。反之，則稱(chēng)為電子密度低。2顯微技術(shù)和顯微鏡中性粒細(xì)胞（透射電鏡）黑白反差結(jié)構(gòu)影像影像較黑稱(chēng)電子密度高反之稱(chēng)電子密度低2顯微技術(shù)和顯微鏡

ＴＥＭ的結(jié)構(gòu)照明系統(tǒng)成像系統(tǒng)真空系統(tǒng)供電系統(tǒng)機(jī)械系統(tǒng)觀察顯示系統(tǒng)電子槍聚光鏡物鏡中間鏡投影鏡2顯微技術(shù)和顯微鏡1.照明系統(tǒng)照明系統(tǒng)主要由電子槍和聚光鏡組成。電子槍是發(fā)射電子的照明光源。聚光鏡是把電子槍發(fā)射出來(lái)的電子會(huì)聚而成的交叉點(diǎn)進(jìn)一步會(huì)聚后照射到樣品上。照明系統(tǒng)的作用就是提供一束亮度高、照明孔徑角小、平行度好、束流穩(wěn)定的照明源。2顯微技術(shù)和顯微鏡電子槍的結(jié)構(gòu)及工作原理圖電子槍是電鏡的電子發(fā)射源，其作用是形成電子束，并控制電子束的發(fā)射，獲得一高亮度和高穩(wěn)定度的照明電子光源由陰極燈絲發(fā)射的電子，通過(guò)柵極上的小孔和電子槍交叉點(diǎn)，即電鏡的實(shí)際電子源。形成射線電子束，經(jīng)高電壓加速后成為高速電子流奔向聚光鏡。電子束在電子槍中是逐級(jí)加速的2顯微技術(shù)和顯微鏡1）陰極又稱(chēng)燈絲，一般由0.08~0.18mm鎢絲作成V或Y形狀。2顯微技術(shù)和顯微鏡2）控制極：調(diào)節(jié)電子的初速度、控制電子束流大小及形狀，工作電壓比燈絲負(fù)100～500V。改變其電位可改變控制電子束的形狀和發(fā)射強(qiáng)度。3）陽(yáng)極：加速?gòu)年帢O發(fā)射出的電子。一般接地。陽(yáng)極與柵極為互相背相的兩個(gè)圓形筒，中間有一個(gè)小圓孔，均用不銹鋼加工制成。2顯微技術(shù)和顯微鏡聚光鏡由于電子之間的斥力和陽(yáng)極小孔的發(fā)散作用，電子束穿過(guò)陽(yáng)極后，逐漸變粗，射到試樣上仍然過(guò)大。聚光鏡有增強(qiáng)電子束密度和再次將發(fā)散的電子會(huì)聚起來(lái)的作用。多為磁透鏡，調(diào)節(jié)其電流控制照明光斑的大小，使在不同的放大倍數(shù)下只照明樣品的被觀察部分，減少樣品不必要的加熱和污染。2顯微技術(shù)和顯微鏡一般裝置雙聚光鏡，第一聚光鏡為一強(qiáng)透鏡，可把電子槍交叉點(diǎn)縮小到1um左右，第二聚光鏡為一弱透鏡，可以把縮小的光斑放大到數(shù)微米并聚焦到樣品上2顯微技術(shù)和顯微鏡電磁透鏡的結(jié)構(gòu)電子源電子軌跡銅導(dǎo)線軟鐵殼軟鐵殼焦點(diǎn)2顯微技術(shù)和顯微鏡2.成像系統(tǒng)由電子透鏡組成，是能使電子束聚焦的裝置。電子透鏡是電鏡的核心部件，其工作方式是利用復(fù)雜的電極和線圈結(jié)構(gòu)形成靜電場(chǎng)和磁場(chǎng)。電子透鏡存在各種像差（aberration），這是影響成像質(zhì)量的主要因素。電子透鏡根據(jù)其作用又分為物鏡、中間鏡和投影鏡。2顯微技術(shù)和顯微鏡2顯微技術(shù)和顯微鏡（1）物鏡成一次像。決定透射電鏡的分辨本領(lǐng)，要求它有盡可能高的分辨本領(lǐng)、足夠高的放大倍數(shù)和盡可能小的像差。通常采用強(qiáng)激磁，短焦距的物鏡。放大倍數(shù)較高，一般為100～300倍。目前高質(zhì)量物鏡分辨率可達(dá)0.1nm左右2顯微技術(shù)和顯微鏡（2）中間鏡成二次像。弱激磁的長(zhǎng)焦距變倍透鏡，0～20倍可調(diào)。（3）投影鏡短焦距強(qiáng)磁透鏡，最后一級(jí)放大像，最終顯示到熒光屏上，稱(chēng)為三級(jí)放大成像。2顯微技術(shù)和顯微鏡電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的光路比較2顯微技術(shù)和顯微鏡3.真空系統(tǒng)由機(jī)械泵、油擴(kuò)散泵或離子泵、聯(lián)動(dòng)控制閥門(mén)、真空排氣管道、空氣過(guò)濾器和用于真空度指示的真空測(cè)量規(guī)等組成。2顯微技術(shù)和顯微鏡4.供電系統(tǒng)透射電鏡需要兩部分電源：一是供給電子槍的高壓部分，二是供給電磁透鏡的低壓穩(wěn)流部分。電源的穩(wěn)定性是電鏡性能好壞的一個(gè)極為重要的標(biāo)志。所以，對(duì)供電系統(tǒng)的主要要求是產(chǎn)生高穩(wěn)定的加速電壓和各透鏡的激磁電流。近代儀器除了上述電源部分外，尚有自動(dòng)操作程序控制系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。2顯微技術(shù)和顯微鏡5.機(jī)械系統(tǒng)包括電鏡座、標(biāo)本室、磁屏蔽外殼、鏡筒、制冷系統(tǒng)和控制臺(tái)等。由于電子易散射或被物體吸收，故穿透力低，必須制備更薄的超薄切片（通常為50～100nm）。2顯微技術(shù)和顯微鏡主要包括取材、固定、包埋、切片、染色等步驟超薄切片技術(shù)厚度：50～100nm1mm32顯微技術(shù)和顯微鏡6.觀察記錄系統(tǒng)人眼無(wú)法觀測(cè)電子，TEM中的電子信息通過(guò)熒光屏和照相底版轉(zhuǎn)換為可觀察圖像。2顯微技術(shù)和顯微鏡硅的晶格排布2顯微技術(shù)和顯微鏡應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)中主要用于觀察組織和細(xì)胞內(nèi)的亞顯維結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)、核酸等大分子的形態(tài)結(jié)構(gòu)及病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)。是區(qū)別細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的最可靠的辦法。2顯微技術(shù)和顯微鏡掃描電子顯微鏡(SEM)2顯微技術(shù)和顯微鏡一、SEM的成像原理電子槍發(fā)出電子束電磁透鏡聚焦形成電子探針激發(fā)樣品產(chǎn)生二次電子偏轉(zhuǎn)線圈使得電子束在樣品表面逐點(diǎn)逐行掃描二次電子探測(cè)器將電子信號(hào)轉(zhuǎn)變成為光信號(hào)光電倍增管形成二次電子脈沖信號(hào)視頻放大器形成電壓模擬信號(hào)在熒光屏顯示圖像或轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)輸入計(jì)算機(jī)2顯微技術(shù)和顯微鏡2顯微技術(shù)和顯微鏡光鏡、透射電鏡和掃描電鏡的工作原理圖2顯微技術(shù)和顯微鏡二次電子探測(cè)器的工作原理圖2顯微技術(shù)和顯微鏡SEM電磁透鏡HITACHI

ModelS-3000N樣品臺(tái)操作系統(tǒng)CRT電子槍電子探頭

樣品室2顯微技術(shù)和顯微鏡電子光學(xué)系統(tǒng)：電子槍、電磁透鏡信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)：二次電子探測(cè)器、光電倍增管圖像顯示和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：CRT掃描系統(tǒng)：偏轉(zhuǎn)線圈、掃描波發(fā)生器真空系統(tǒng)：機(jī)械泵、油擴(kuò)散泵、閥門(mén)等電源：高壓電源、真空系統(tǒng)電源等SEM的基本結(jié)構(gòu)2顯微技術(shù)和顯微鏡掃描系統(tǒng)掃描偏轉(zhuǎn)線圈（電子束偏轉(zhuǎn)器）—

隨電流波形而產(chǎn)生變化磁場(chǎng)，推動(dòng)電子束偏轉(zhuǎn)移動(dòng)，使電子探針在樣品上以一定的方式和速度移動(dòng)掃描信號(hào)發(fā)生器—

產(chǎn)生掃描脈沖信號(hào)，同步提供給鏡體和顯示器中的掃描線圈2顯微技術(shù)和顯微鏡SEM的應(yīng)用主要用來(lái)觀查組織、細(xì)胞表面或斷裂面的超微結(jié)構(gòu)及較大的顆粒性樣品的表面形態(tài)結(jié)構(gòu)2顯微技術(shù)和顯微鏡SEMTEM

最高分辨率3～10nm0.1~0.3nm放大率7～200,000100~800,000加速電壓1~30kv20~200kv成像原理二次電子透射電子樣品大小10mm2×5mm1mm3

觀察對(duì)象表面形貌內(nèi)部結(jié)構(gòu)制樣方法較易復(fù)雜操作維護(hù)方便復(fù)雜SEM與TEM的比較2顯微技術(shù)和顯微鏡掃描電鏡照片展示注射針頭的掃描電鏡照片2顯微技術(shù)和顯微鏡掃描電鏡照片展示紅血球可以用計(jì)算機(jī)將黑白照片處理成彩色2顯微技術(shù)和顯微鏡放大倍率范圍廣掃描電鏡特點(diǎn)立體感強(qiáng)2顯微技術(shù)和顯微鏡掃描隧道顯微鏡（STM）2顯微技術(shù)和顯微鏡

量子理論中的隧道效應(yīng)極細(xì)探針與研究物質(zhì)作為兩個(gè)極隧道電流STM的工作原理2顯微技術(shù)和顯微鏡STM的工作原理利用量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)，在樣品與探針之間加一定（1V左右）的電壓，當(dāng)樣品與針尖距離非常接近（小于1nm）時(shí)，樣品和針尖之間將產(chǎn)生隧道電流隧道電流的大小和兩極之間的距離呈指數(shù)關(guān)系2顯微技術(shù)和顯微鏡STM的基本裝置工作過(guò)程：利用探針針尖掃描樣品，通過(guò)隧道電流獲取信息，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理得到圖象。2顯微技術(shù)和顯微鏡STM探針：金屬絲經(jīng)化學(xué)腐蝕，在腐蝕斷裂瞬間切斷電流，獲得尖峰，曲率半徑為10nm左右。STM

針尖STM的基本裝置2顯微技術(shù)和顯微鏡掃描器檢測(cè)電路輸出樣品運(yùn)動(dòng)軌跡STM的掃描模式特點(diǎn)：掃描速度快，噪音減少，但不能用于觀察表面起伏大于1nm的樣品。（1）恒高測(cè)量模式：探針以不變高度在樣品表面掃描，隧道電流隨試件表面起伏而變化，從而得到樣品表面形貌信息。2顯微技術(shù)和顯微鏡STM的掃描模式樣品輸出運(yùn)動(dòng)軌跡驅(qū)動(dòng)電路掃描器檢測(cè)電路控制器（2）恒電流測(cè)量模式：探針在樣品表面掃描，使用反饋電路驅(qū)動(dòng)探針，使探針與樣品表面之間距離（隧道間隙）不變。此時(shí)探針移動(dòng)直接描繪了樣品表面形貌。特點(diǎn)：此種測(cè)量模式隧道電流對(duì)隧道間隙的敏感性轉(zhuǎn)移到反饋電路驅(qū)動(dòng)電壓與位移之間的關(guān)系上，避免了非線性