營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的篩選課件

2第7章工業(yè)微生物誘變育種25營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的篩選野生型菌株（wildtypestrain）：從自然界分離到的微生物在其發(fā)生突變前的原始菌株?duì)I養(yǎng)缺陷型（auxotroph)：野生型菌株經(jīng)過(guò)人工誘變或自然變異失去合成某種必需營(yíng)養(yǎng)（氨基酸、維生素、核苷酸等）的能力，只有在基本培養(yǎng)基中補(bǔ)充所缺乏的營(yíng)養(yǎng)因子(生長(zhǎng)因子)才能生長(zhǎng)繁殖原養(yǎng)型（prototroph）:營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株經(jīng)過(guò)回復(fù)突變或重組變異后產(chǎn)生的菌株，其營(yíng)養(yǎng)要求與野生型菌株相同2第7章工業(yè)微生物誘變育種2營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株篩選有關(guān)培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基（minimalmedium,MM）：僅能滿足野生型菌株生長(zhǎng)需要完全培養(yǎng)基（completemedium,CM）：凡可以滿足一切營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株?duì)I養(yǎng)需要的天然或半合成培養(yǎng)基補(bǔ)充培養(yǎng)基（supplementalmedium,SM）：只能滿足相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株生長(zhǎng)需要，是在基本培養(yǎng)基中加入了相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株所不能合成的營(yíng)養(yǎng)因子。2第7章工業(yè)微生物誘變育種25.1營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的選育

營(yíng)養(yǎng)缺陷性突變?yōu)椋▎我唬┗蛲蛔儯钱a(chǎn)生某種營(yíng)養(yǎng)因子的代謝途徑中某個(gè)關(guān)鍵酶合成基因突變?cè)斐上鄳?yīng)酶不能產(chǎn)生或不能發(fā)揮作用，從而造成相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)因子不能產(chǎn)生誘發(fā)突變篩選1步：淘汰野生型菌株篩選2步：檢出缺陷類型篩選3步：鑒別缺陷種類2第7章工業(yè)微生物誘變育種25.1.1營(yíng)養(yǎng)缺陷型的誘變

多用亞硝基胍（NTG）、UV、亞硝酸等做誘變劑；其中亞硝基胍（NTG）誘發(fā)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的頻率極高，一般可達(dá)10％；電離輻射損傷大，一般不適宜做營(yíng)養(yǎng)缺陷型誘變劑；用完全培養(yǎng)基做后培養(yǎng)2第7章工業(yè)微生物誘變育種25.1.2淘汰野生型菌株

方法1：抗生素法

細(xì)菌：

用加有青霉素的基本培養(yǎng)基分離培養(yǎng)誘變處理后的菌體，野生型菌株因?yàn)榉敝钞a(chǎn)生的子細(xì)胞不能合成正常細(xì)胞壁而死亡，而對(duì)不能繁殖的營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞因?yàn)樵诨九囵B(yǎng)基中不能繁殖而得以保留具體方法和步驟見(jiàn)P1762第7章工業(yè)微生物誘變育種25.1.2淘汰野生型菌株

方法1：抗生素法酵母菌：用加有制霉菌素基本培養(yǎng)基分離培養(yǎng)誘變處理后的菌體，制霉菌素抑制真菌細(xì)胞壁中甾醇合成，從而使繁殖中的細(xì)胞產(chǎn)生的子細(xì)胞死亡，保留營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞2第7章工業(yè)微生物誘變育種2方法2：菌絲過(guò)濾法

真菌和放線菌等絲狀菌的野生型菌株在基本培養(yǎng)基中產(chǎn)生菌絲體，而營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株以孢子形式存在，不能萌發(fā)。把誘變處理后的孢子懸液用液體基本培養(yǎng)基培養(yǎng)，適溫振蕩培養(yǎng)，使野生型孢子萌發(fā)形成菌絲體，用滅菌脫脂棉、濾紙等除去菌絲體，再培養(yǎng)，再過(guò)濾。重復(fù)3～4次，最大限度地除去野生型菌株，然后再分離2第7章工業(yè)微生物誘變育種2方法3：高溫殺菌法

對(duì)產(chǎn)芽孢菌，先用完全培養(yǎng)基對(duì)誘變后的菌株培養(yǎng)到產(chǎn)生芽孢，再用基本培養(yǎng)基培養(yǎng)一定時(shí)間，野生型芽孢萌發(fā)成營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，缺陷型芽孢不能萌發(fā)，這時(shí)用80℃處理一定時(shí)間，野生型營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞被殺滅，而缺陷型芽孢因?yàn)槟蜔岫婊睢?第7章工業(yè)微生物誘變育種25.1.3營(yíng)養(yǎng)缺陷型的檢出

方法1：點(diǎn)植對(duì)照法（見(jiàn)圖7.12)2第7章工業(yè)微生物誘變育種25.1.3營(yíng)養(yǎng)缺陷型的檢出

方法2：影印法（見(jiàn)圖7.13)2第7章工業(yè)微生物誘變育種25.1.3營(yíng)養(yǎng)缺陷型的檢出

方法3：夾層法（見(jiàn)圖7.14)2第7章工業(yè)微生物誘變育種25.1.3營(yíng)養(yǎng)缺陷型的檢出

方法3：限量補(bǔ)充法P178

在基本培養(yǎng)基中補(bǔ)充微量營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株所不能合成的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，野生型菌株生長(zhǎng)快、菌落大，而營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株生長(zhǎng)慢、菌落小。2第7章工業(yè)微生物誘變育種25.1.4營(yíng)養(yǎng)缺陷型的鑒定

測(cè)定營(yíng)養(yǎng)缺陷菌株所需營(yíng)養(yǎng)因子的種類5.1.4.1鑒定方法

方法一：把純化好的缺陷型菌株與基本培養(yǎng)基倒混合平板或涂布平板，再在平板上點(diǎn)接各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（最好稀釋成一定濃度，用濾紙片法接入），適溫培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)圈。此法可以在一個(gè)平板上對(duì)一株菌進(jìn)行多種營(yíng)養(yǎng)因子進(jìn)行測(cè)定方法二：在基本培養(yǎng)基中加入某種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，倒混合平板，再點(diǎn)接菌株，觀察生長(zhǎng)圈。此法可同時(shí)對(duì)多個(gè)菌株進(jìn)行測(cè)定2第7章工業(yè)微生物誘變育種25.1.4.2缺陷型鑒定步驟

營(yíng)養(yǎng)因子類別測(cè)定→營(yíng)養(yǎng)因子種類測(cè)定→復(fù)證試驗(yàn)步驟1：缺陷型營(yíng)養(yǎng)因子類別測(cè)定：用各類營(yíng)養(yǎng)因子的代表物質(zhì)的混合物：

氨基酸混合物、酪素水解物或代表氨基酸類酵母浸汁，其中氨基酸、維生素、堿基都有維生素混合物，代表維生素類核酸堿基混合物，代表核苷酸類2第7章工業(yè)微生物誘變育種2步驟2：缺陷型營(yíng)養(yǎng)因子種類測(cè)定

缺陷型營(yíng)養(yǎng)因子類別確定后，再用該類營(yíng)養(yǎng)因子的各種代表物質(zhì)純凈物做試驗(yàn)，以確定其缺陷哪一種或幾種營(yíng)養(yǎng)因子?？梢韵劝言擃愇镔|(zhì)分成幾組進(jìn)行測(cè)定，逐步縮小范圍，最后菌體測(cè)定到種類(P180)

常用濃度：氨基酸1~10mg/mL;維生素類0.01~0.1mg/mL

氨基酸和維生素分組分別見(jiàn)P182表7.14和表7.152第7章工業(yè)微生物誘變育種25.2營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的應(yīng)用工業(yè)微生物育種中，用于積累代謝中間產(chǎn)物作為雜交、重組育種的遺傳標(biāo)記用于微生物代謝途徑研究在轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、原生質(zhì)體融合、質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子研究中用作標(biāo)記菌株2第7章工業(yè)微生物誘變育種26溫度敏感突變株的篩選P184

溫度敏感突變株（temperature-sensitivemutant,TS突變體）：突變株在一定溫度范圍內(nèi)（許可溫度）正常生長(zhǎng)，其表型和野生型沒(méi)有區(qū)別，但超出這一溫度范圍（非許可溫度），則不能生長(zhǎng)或生長(zhǎng)微弱甚至死亡（條件致死）或某些代謝停止或減弱。

TS突變主要是由必需基因發(fā)生突變，致使該基因在一定溫度條件下無(wú)法正常表達(dá)，或其編碼的酶失活，造成細(xì)胞不能正常生長(zhǎng)。2第7章工業(yè)微生物誘變育種26.1TS突變株的選育方法6.1.1TS突變株的誘發(fā)

TS突變主要由基因錯(cuò)義突變所致，要選擇易于引起堿基置換的亞硝基類、磺酸酯類化合物，或亞硝酸、UV等誘變劑。6.1.2淘汰野生型菌株/TS菌株富集培養(yǎng)

1抗生素法：加入抗生素，在非許可溫度下培養(yǎng)一定時(shí)間，殺滅在該溫度下生長(zhǎng)的野生型菌株，再離心除去抗生素，分離

2其它方法(P185)H3放射性同位素前體法2第7章工業(yè)微生物誘變育種26.1.3TS突變株分離篩選

富集培養(yǎng)后，用完全培養(yǎng)基先在許可溫度下培養(yǎng)，再用影印法、點(diǎn)植法等方法在許可溫度和非許可溫度下分別培養(yǎng)，對(duì)照結(jié)果即可檢出TS突變體；也可同一平板先在非許可溫度培養(yǎng)，長(zhǎng)出野生型菌株，做好記號(hào)，再轉(zhuǎn)許可溫度培養(yǎng)，則后長(zhǎng)出的為T(mén)S菌株。2第7章工業(yè)微生物誘變育種26.2TS突變株在發(fā)酵工業(yè)中應(yīng)用6.2.1在谷氨酸發(fā)酵中的應(yīng)用增加谷氨酸產(chǎn)量的關(guān)鍵在于改變菌體的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能，通過(guò)一些有效方法使谷氨酸產(chǎn)生菌由谷氨酸非積累型轉(zhuǎn)變?yōu)榉e累型。

Momose等以乳糖發(fā)酵桿菌NO2256為出發(fā)菌株，選育出細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)或功能缺損的TS突變株88號(hào)，通過(guò)溫度來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞膜透性。當(dāng)在許可溫度(30℃)下培養(yǎng)繁殖得到一定量菌體后，升溫致非許可溫度(37℃)培養(yǎng)，使細(xì)胞膜的合成、結(jié)構(gòu)或功能發(fā)生障礙，結(jié)果突變株能在高濃度生物素培養(yǎng)基中分泌大量谷氨酸。2第7章工業(yè)微生物誘變育種26.2.2TS突變株在絲氨酸發(fā)酵中的應(yīng)用P189

以C1化合物為唯一碳源的微生物合成細(xì)胞組分是通過(guò)絲氨酸途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的（見(jiàn)圖7.19).要提高絲氨酸產(chǎn)量，關(guān)鍵在于阻斷絲氨酸降解。日本味之素公司的Moringga篩選到TS突變株，它們?cè)?0℃絲氨酸降解正常，但在38～40℃失去降解絲氨酸的能力，因而大量分泌絲氨酸6.2.3微生物單細(xì)胞蛋白（SCP）的生產(chǎn)

P1892第7章工業(yè)微生物誘變育種27抗噬菌體菌株的選育7.1噬菌體概述噬菌體的特點(diǎn)烈性噬菌體及其繁殖溫和性噬菌體及其繁殖---溶源化噬菌體的專一性噬菌體的變異2第7章工業(yè)微生物誘變育種27.1噬菌體概述專一性噬菌體的獲得、純化噬菌斑烈性噬菌體效價(jià)測(cè)定－重層瓊脂法（見(jiàn)P192圖7.20)

每mL中所含有的侵染性噬菌體粒子數(shù)稱為效價(jià)，單位為U/mL2第7章工業(yè)微生物誘變育種2刺突tailpins噬菌體形態(tài)（Phage,bacteriophage）95nm95nmheadnecktail（24環(huán)）尾絲(tailfibers)65nm2第7章工業(yè)微生物誘變育種2烈性噬菌體繁殖---裂解途徑JSU-micro吸附：病毒表面的結(jié)合蛋白與細(xì)胞的受體蛋白形成專一結(jié)合。病毒有較嚴(yán)格的宿主專一性侵入與脫殼：病毒粒子進(jìn)入細(xì)胞并蛻去衣殼，關(guān)鍵是病毒核酸進(jìn)入細(xì)胞。囊膜和衣殼脫去，核酸釋放，病毒粒子解體釋放：病毒粒子從細(xì)胞中釋放，（再去侵染周?chē)钠渌?xì)）。裂解式：細(xì)胞破裂，病毒粒子一起釋放，出現(xiàn)一步生長(zhǎng)；溫和式：細(xì)胞不死不破，病毒粒子逐步釋放，囊膜病毒此時(shí)獲得囊膜生物合成：病毒核酸轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、蛋白合成。由病毒遺傳信息“指揮”，細(xì)胞執(zhí)行，合成出多套病毒核酸和衣殼蛋白裝配：生物合成的多套病毒核酸和衣殼蛋白組裝成很多完整的病毒粒子。依靠生物大分子間的分子作用力自動(dòng)完成2第7章工業(yè)微生物誘變育種2繁殖---烈性噬菌體的裂解途徑JSU-micro2第7章工業(yè)微生物誘變育種2噬菌斑(plaque)：在培養(yǎng)敏感指示菌的平板上因病毒繁殖而使一定區(qū)域的菌體裂解，出現(xiàn)透明的溶菌斑塊下層培養(yǎng)基雙層培養(yǎng)基敏感菌+上層培養(yǎng)基噬菌體稀釋液培養(yǎng)噬菌斑噬菌斑敏感菌菌苔JSU-micro2第7章工業(yè)微生物誘變育種2雙層平板法瓊脂平板菌液+噬菌體試樣+瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)10天計(jì)數(shù)噬菌斑噬菌斑數(shù)=單位試樣中噬菌體數(shù)2第7章工業(yè)微生物誘變育種2噬菌斑照片JSU-micro2第7章工業(yè)微生物誘變育種2繁殖－溫和噬菌體的溶源化途徑有些噬菌體侵入細(xì)菌后，其核酸能整合到細(xì)菌染色體上,成為前噬菌體，與細(xì)菌染色體一起復(fù)制、一起傳給子細(xì)胞。這類噬菌體稱為溫和噬菌體，這種繁殖途徑稱為溶源化途徑；含有前噬菌體的細(xì)菌稱為溶源化細(xì)菌。前噬菌體偶爾會(huì)脫離細(xì)菌染色體，自行消失，或進(jìn)入裂解途徑大量繁殖，裂解細(xì)菌JSU-micro2第7章工業(yè)微生物誘變育種2溶源菌的特性細(xì)菌的溶源性具有遺傳性溶源菌對(duì)同源噬菌體具有免疫性溶源性細(xì)菌在培養(yǎng)中不易被查覺(jué)非溶源細(xì)胞自發(fā)裂解和誘導(dǎo)裂解：有少數(shù)前噬菌體可自發(fā)或誘發(fā)裂解宿主細(xì)胞，進(jìn)入裂解途徑溶源性細(xì)胞可獲得一些新的生理特性復(fù)愈:溶源菌失去前噬菌體2第7章工業(yè)微生物誘變育種2烈性噬菌體污染造成發(fā)酵工業(yè)損失嚴(yán)重：輕者使發(fā)酵周期延長(zhǎng)、產(chǎn)量下降，重者造成倒罐溫和噬菌體污染難于發(fā)覺(jué)噬菌體危害的防治：定期更換菌種、抗噬菌體菌株選育、藥物防治JSU-micro噬菌體的危害及其防治2第7章工業(yè)微生物誘變育種27.2抗噬菌體菌株的選育程序

抗噬菌體菌株的選育程序（以專一噬菌體做選擇因子）：菌株誘變處理→分離在含有噬菌體的平板上→挑取抗性菌落，制備斜面菌種→用含有噬菌體的液體培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)篩選（重復(fù)2～3次）→分離在含有噬菌體的平板上→挑取抗性菌落→抗性菌株的特性試驗(yàn)具體過(guò)程見(jiàn)P195~1962第7章工業(yè)微生物誘變育種27.3抗噬菌體菌株的特性研究7.3.1抗噬菌體穩(wěn)定性試驗(yàn)：分別接種到含高濃度噬菌體的斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定時(shí)間，再用重層瓊脂法培養(yǎng)，看是否出現(xiàn)噬菌斑；還要做連續(xù)傳代培養(yǎng)，看抗性是否穩(wěn)定。7.3.2抗性菌株的產(chǎn)量性能7.4抗噬