免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理課件

第一節(jié)體外抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的特點(diǎn)及影響因素第二節(jié)檢測抗原和抗體的體外試驗(yàn)第三節(jié)免疫細(xì)胞功能的測定第22章免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理22_免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理第一節(jié)體外免疫反應(yīng)的特點(diǎn)及影響因素※※(一)抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)高度特異性特異性越強(qiáng)，親和力也越高；表面化學(xué)基團(tuán)之間的可逆結(jié)合抗原抗體結(jié)合除了空間結(jié)構(gòu)互補(bǔ)外，主要以氫鍵、靜電引力、范德華力和疏水鍵等非共價(jià)結(jié)合。不如共價(jià)鍵穩(wěn)定，易受溫度、酸堿度和離子強(qiáng)度的影響而解離，解離后抗原抗體仍具有原有特性；適宜的抗原抗體濃度和比例決定抗原抗體結(jié)合后能否出現(xiàn)肉眼可見的反應(yīng)；抗原抗體反應(yīng)的2個階段第1階段是抗原抗體特異性結(jié)合，可在數(shù)秒鐘至幾分鐘內(nèi)完成；第2階段是小的抗原抗體復(fù)合物靠正負(fù)電荷吸引形成較大復(fù)合物，所需時(shí)間從數(shù)分鐘至數(shù)日不等。22_免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理(二)抗原抗體反應(yīng)的影響因素電解質(zhì)抗原抗體等電點(diǎn)分別為pH3-5和pH5-6，在中性或弱堿性條件下表面帶有較多負(fù)電荷，適當(dāng)濃度的電解質(zhì)會使它們失去一部分負(fù)電荷而相互結(jié)合；溫度通常為37℃，適當(dāng)提高反應(yīng)溫度可增加抗原與抗體分子的碰撞機(jī)會，但56℃以上可使抗原或抗體變性失活；酸堿度抗原抗體反應(yīng)的最適pH值在6-8之間，pH值過高或過低均可直接影響抗原抗體的理化性質(zhì)。當(dāng)pH值接近等電點(diǎn)時(shí)，抗原抗體多帶正負(fù)電荷相等，由于自身吸引而出現(xiàn)凝集，導(dǎo)致非特異性反應(yīng)。22_免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理第二節(jié)檢測抗原和抗體的體外實(shí)驗(yàn)22_免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理AbAg高親和力AbAg低親和力特異性結(jié)合力的表示方法親和力和親合力低親合力高親合力Ag-Ab反應(yīng)的原理22_免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理Ab過剩Ag過剩比例適當(dāng)，交聯(lián)成網(wǎng)絡(luò)Ag-Ab反應(yīng)的可見性22_免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理1.凝集反應(yīng)直接凝集反應(yīng)1:2稀釋待測血清1:41:81:16細(xì)菌、細(xì)胞等顆粒性Ag或表面包被抗原的顆粒狀物質(zhì)與相應(yīng)Ab在電解質(zhì)存在的情況下結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見的凝集團(tuán)現(xiàn)象。玻片法試管法常用于菌種鑒定或ABO血型鑒定常用于檢測抗體的滴度或效價(jià)，見于臨床診斷傷寒或副傷寒所用的肥達(dá)氏反應(yīng)和診斷布氏菌病所用的瑞特試驗(yàn)。22_免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理間接凝集反應(yīng)將可溶性Ag/Ab先吸附在某些顆粒載體上，形成致敏顆粒，然后再與相應(yīng)Ab/Ag進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)生凝集，叫間接凝集反應(yīng)。如將溶血毒素O吸附于乳膠顆粒上的抗“O”試驗(yàn)、人IgG作為Ag吸附于乳膠顆粒上的類風(fēng)濕因子檢測。凝集反應(yīng)常用于溶血性疾病的診斷：+YYYYYYYYYYYY病人的RBC體內(nèi)anti-Rh由于抗體多屬于IgG，分子量較小，抗體與紅細(xì)胞間的結(jié)合力不能克服細(xì)胞間的排斥力，不出現(xiàn)凝集+YYYYYYYYYYYYYYY體外加入抗人IgG出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，叫直接庫姆試驗(yàn)正常人O型血的Rh+的RBC+YYYY患者血清內(nèi)的游離anti-Rh+Y體外加入抗人IgGYYYYYYYYYYYYYY出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，叫間接庫姆試驗(yàn)22_免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理2.沉淀反應(yīng)AgAgAgAgAbingel單向免疫擴(kuò)散Ag1AbAg2Ag3Ag4雙向免疫擴(kuò)散免疫比濁過量AbAbAbAb毒素、組織浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原與相應(yīng)抗體反應(yīng)后，出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物，稱為沉淀反應(yīng)。沉淀反應(yīng)可在液體中進(jìn)行，也可在半固體瓊脂凝膠中進(jìn)行。鑒定多種抗原是完全相同、部分相同或完全不同用于確定抗原濃度22_免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理沉淀反應(yīng)—免疫電泳存在于不同區(qū)域的抗原與抗體結(jié)合，在比例適宜處形成沉淀弧。沉淀弧的數(shù)量、位置和形狀與標(biāo)準(zhǔn)品相對比，可分析樣品的成分及其性質(zhì)。22_免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理3.免疫標(biāo)記技術(shù)免疫酶測定法免疫熒光技術(shù)放射免疫測定法免疫膠體金技術(shù)22_免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理①免疫酶測定法夾心法ELISA間接ELISABAS—ELISA利用生物素和抗生物素蛋白為橋梁微粒捕獲酶免疫分析技術(shù)將已知特異性抗體致敏的免疫微粒與生物素、親和素、酶相結(jié)合，最后酶作用于熒光底物發(fā)光，通過檢測熒光強(qiáng)度判斷未知抗原的含量。a）b）22_免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理免疫組化技術(shù)定位、定性、定量檢測22_免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理②免疫熒光技術(shù)22_免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理③放射免疫測定用放射性核素標(biāo)記抗原或抗體進(jìn)行的免疫測定。將同位素的敏感性與抗原抗體結(jié)合的特異性結(jié)合起來，具有重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于激素、藥物等微量物質(zhì)的檢測。常用的有131I、125I。④化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)將化學(xué)發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新的免疫分析技術(shù)。最常用的發(fā)光物質(zhì)是魯米諾。靈敏度高、簡便、可實(shí)現(xiàn)自動化分析。22_免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理⑤免疫膠體金技術(shù)用膠體金顆粒標(biāo)記Ab/Ag，以檢測未知Ag/Ab的方法。氯金酸在還原劑作用下，可聚合成特定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液，因靜電作用而呈穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。該技術(shù)可應(yīng)用于免疫組化(光鏡下檢查)和免疫層析快速診斷。22_免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理⑥免疫印跡法-Westernblotting22_免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理4.蛋白質(zhì)芯片技術(shù)又稱為蛋白質(zhì)微列陣，指固定于支持介質(zhì)上的大量蛋白質(zhì)構(gòu)成的微列陣。根據(jù)蛋白質(zhì)分子間特異性結(jié)合的原理，可實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、高通量的檢測。22_免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理第三節(jié)免疫細(xì)胞功能的檢測淋巴細(xì)胞及其亞群的分離免疫細(xì)胞功能測定磁珠分離法免疫吸附分離法流式細(xì)胞術(shù)肽—MHC四聚體技術(shù)T細(xì)胞功能測定B細(xì)胞功能測定細(xì)胞因子檢測T細(xì)胞增殖試驗(yàn)遲發(fā)型超敏反應(yīng)的檢測抗體含量測定溶血空斑試驗(yàn)巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)細(xì)胞毒試驗(yàn)吞噬功能測定51Cr釋放法乳酸脫氫酶釋放法細(xì)胞染色法凋亡細(xì)胞檢測法硝基藍(lán)四氮唑試驗(yàn)生物活性檢測法免疫學(xué)檢測法22_免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理外周血單個核細(xì)胞的分離稀釋血液淋巴細(xì)胞分離液(葡聚糖-泛影葡胺r=1.078)離心單個核細(xì)胞(PBMC，包括淋巴細(xì)胞、DC和NK)紅細(xì)胞和粒細(xì)胞血漿22_免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理磁珠分離法免疫吸附分離法流式細(xì)胞術(shù)肽—MHC四聚體技術(shù)淋巴細(xì)胞及其亞群的分離22_免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理免疫吸附分離法加入淋巴細(xì)胞懸液anti-CD4anti-CD4anti-CD4棄上清22_免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理磁珠分離法22_免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理流式細(xì)胞術(shù)熒光抗體標(biāo)記混合細(xì)胞噴嘴單細(xì)胞懸液5000-10000個/秒細(xì)胞分選器熒光檢測器22_免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理抗原肽-MHC四聚體分離技術(shù)親和素抗原肽MHCI生物素anti-CD8肽-四聚體肽特異性CD8TCD4T及B非肽特異性CD8T熒光素22_免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理二、免疫細(xì)胞功能的測定T細(xì)胞功能測定B細(xì)胞功能測定細(xì)胞因子檢測T細(xì)胞增殖試驗(yàn)遲發(fā)型超敏反應(yīng)的檢測抗體含量測定溶血空斑試驗(yàn)巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)細(xì)胞毒試驗(yàn)吞噬功能測定51Cr釋放法乳酸脫氫酶釋放法細(xì)胞染色法凋亡細(xì)胞檢測法硝基藍(lán)四氮唑試驗(yàn)生物活性檢測法免疫學(xué)檢測法22_免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理T細(xì)胞功能測定T細(xì)胞增殖試驗(yàn)遲發(fā)型超敏反應(yīng)的檢測T細(xì)胞受到特異性抗原或有絲分裂原刺激后發(fā)生增殖，可通過以下三種方法檢測：形態(tài)計(jì)數(shù)法：活化細(xì)胞體積增大、形態(tài)不規(guī)則、胞質(zhì)增多、細(xì)胞核松散及出現(xiàn)較多核仁；3H-TdR或125I-UdR摻入法：3H-TdR能摻入到合成的DNA中，用液體閃爍儀檢測樣品的放射活性，特點(diǎn)是靈敏可靠，但須特殊儀器，易有放射性污染。MTT(四甲基偶氮唑鹽)比色法：外來抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答后，再用相同的抗原作皮試，可導(dǎo)致遲發(fā)型超敏反應(yīng)，T細(xì)胞活化并釋放多種細(xì)胞因子，產(chǎn)生以單個核細(xì)胞浸潤為主的炎癥，局部發(fā)生充血滲出，24-48h發(fā)生，72h到達(dá)高峰。陽性反應(yīng)表現(xiàn)為局部紅腫和硬結(jié)，反應(yīng)強(qiáng)烈的發(fā)生水腫甚至壞死。細(xì)胞免疫正常者出現(xiàn)陽性反應(yīng)，細(xì)胞免疫低下者呈弱陽性或陰性反應(yīng)。常用于檢測某些微生物感染。22_免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理B細(xì)胞功能測定抗體含量測定溶血空斑試驗(yàn)可通過單項(xiàng)瓊脂擴(kuò)散法、ELISA、速率比濁法等測定標(biāo)本中各類Ig的含量。綿羊紅細(xì)胞(SRBC)免疫動物4天后取出動物脾臟，在脾細(xì)胞懸液中含有抗SRBC的漿細(xì)胞脾細(xì)胞與SRBC在適量瓊脂糖液中混勻在抗體形成細(xì)胞周圍出現(xiàn)溶解的透明區(qū)，即溶血空斑。1個空斑區(qū)代表1個漿細(xì)胞通過記錄溶血空斑的數(shù)目可知抗原特異性B細(xì)胞的數(shù)目加入新鮮補(bǔ)體，倒入平皿中培養(yǎng)22_免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理細(xì)胞毒試驗(yàn)51Cr釋放法乳酸脫氫酶釋放法細(xì)胞染色法靶細(xì)胞被殺傷后，向體系中加入臺盼蘭，可進(jìn)入膜破損的細(xì)胞內(nèi)，將細(xì)胞染成藍(lán)色?；罴?xì)胞拒染而不著色。22_免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理凋亡細(xì)胞檢測法瓊脂糖電泳法正常細(xì)胞基因組DNA凋亡細(xì)胞TUNEL法在細(xì)胞中加入末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)和生物素標(biāo)記的核苷酸TdT能在游離的DNA3’端缺口連接標(biāo)記的核苷酸加入親和素-酶復(fù)合物，在DNA斷裂處顯色流式細(xì)胞術(shù)AnnexinVPI凋亡早期凋亡晚期壞死期22_免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)吞噬功能測定硝基藍(lán)四氮唑(NBT)試驗(yàn)NBT在殺菌過程中產(chǎn)生反應(yīng)性氧中間物，其中超氧陰離子能使被吞噬進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的NBT還原成不溶性藍(lán)黑色甲臜顆粒，沉積于胞漿中。光鏡下計(jì)數(shù)NBT陽性細(xì)胞可反映PMN的殺傷功能。將待測mf與雞紅細(xì)胞混合溫育后，雞紅細(xì)胞被mf吞噬，根據(jù)吞噬百分率確定mf吞噬能力。吞噬百分率=吞有紅細(xì)胞的mf/mf總數(shù)22_免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理