色譜法在精細(xì)化工中的應(yīng)用課件

色譜法在精細(xì)化工中的應(yīng)用3-3高效液相色譜3.3高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPLC）是以經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)，引入了氣相色譜的理論與實(shí)驗(yàn)方法，流動(dòng)相用高壓泵輸送，采用高效固定相和在線檢測(cè)等手段發(fā)展而成的分離分析方法。3-3高效液相色譜特點(diǎn)：高壓、高效、高速高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣的高效分離分析方法。溶質(zhì)在液體中的擴(kuò)散系數(shù)比氣體中約小105倍液體粘度比氣體約大102倍液體表面張力比氣體約大104倍液體密度比氣體約大103倍液體不可壓縮一、高效液相色譜法的特點(diǎn)3-3高效液相色譜二、高效液相色譜法的應(yīng)用與氣相色譜法相比具有：適用范圍廣，樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單，分離效率高，流動(dòng)相選擇范圍廣，檢測(cè)方法多為非破壞性的，流出組分可回收等優(yōu)點(diǎn)。高效液相色譜法主要用于化合物的分離、鑒定、純化以及定量。3-3高效液相色譜三、高效液相色譜法的幾種類型HPLC液-固吸附液-液分配正相色譜反相色譜一般反相色譜離子對(duì)色譜離子抑制色譜離子交換色譜一般離子交換色譜離子色譜氨基酸分析凝膠色譜凝膠滲透色譜凝膠過(guò)濾色譜鍵合相色譜3-3高效液相色譜四、高效液相色譜儀檢測(cè)器高壓泵脫氣裝置色譜柱進(jìn)樣閥流動(dòng)相3-3高效液相色譜多用柱塞往復(fù)泵，柱塞向前運(yùn)動(dòng)，液體輸出，流向色譜柱；向后運(yùn)動(dòng)，將貯液瓶中液體吸入缸體。如此往復(fù)運(yùn)動(dòng)，將流動(dòng)相源源不斷地輸送到色譜柱中。柱塞往復(fù)泵屬于恒流泵，流量不受柱阻影響，泵壓最高為400kg/cm2。這種泵具有清洗容易，更換流動(dòng)相方便等優(yōu)點(diǎn)，但脈動(dòng)性較大是其缺點(diǎn)。目前多采用雙泵補(bǔ)償法來(lái)克服這一問(wèn)題。輸液泵3-3高效液相色譜3-3高效液相色譜避免使用對(duì)不銹鋼有腐蝕性的溶劑。例：硝酸、硫酸、鹽酸、鹵化物，四氯化碳與異丙醇或四氫呋喃的混合物，含強(qiáng)絡(luò)合劑的溶液等。注意流動(dòng)相使用前

使用含酸、堿、緩沖液的流動(dòng)相后，必須用不含鹽的有機(jī)溶劑-水沖洗！沖洗3-3高效液相色譜3-3高效液相色譜3-3高效液相色譜3-3高效液相色譜進(jìn)樣閥3-3高效液相色譜1柱泵324定量圈進(jìn)樣孔6廢液5廢液Inject6柱泵3214定量圈進(jìn)樣孔廢液5廢液Load3-3高效液相色譜注意：使用后應(yīng)清洗！3-3高效液相色譜進(jìn)樣注意點(diǎn)進(jìn)樣閥的廢液出口端高度必須與進(jìn)樣針在同一水平位置，以免虹吸作用，使樣品向針筒方向回流，或從廢液口流出。使用前后，要用流動(dòng)相（不含酸堿等緩沖液）或甲醇或水沖洗針孔，用針孔清洗器）。3-3高效液相色譜進(jìn)樣方法整個(gè)定量圈體積進(jìn)樣——為獲得好的精密度，進(jìn)樣量應(yīng)大于定量圈量的2-5倍以上。由于層流影響，需要有過(guò)量的樣品液來(lái)取代管壁上的流動(dòng)相（見(jiàn)下圖）。SampleMobilephase3-3高效液相色譜例20l定量圈，進(jìn)樣體積不能超過(guò)10l。否則，部分樣品將會(huì)從出口流失。這是因?yàn)橛捎趯恿鞯年P(guān)系，樣品流經(jīng)管中心的速度是平均速度的兩倍。進(jìn)樣前應(yīng)用流動(dòng)相沖洗進(jìn)樣孔，以除去前一針留下的樣品。注射針必須清洗干凈。部分定量圈體積進(jìn)樣——當(dāng)樣品量少時(shí)，采用部分體積進(jìn)樣，進(jìn)樣量由微量注射器手動(dòng)控制，要求：不得超過(guò)定量圈體積的1/2量3-3高效液相色譜色譜柱色譜柱由柱管和固定相組成，柱管用不銹鋼制成，柱長(zhǎng)10～30cm，內(nèi)徑2～6mm，以4.6mm的內(nèi)徑最常用。根據(jù)鍵合基團(tuán)極性不同，化學(xué)鍵合相可分為非極性、中等極性和極性三類。常用色譜柱有：ODS柱、氰基柱、氨基柱等3-3高效液相色譜色譜柱使用注意點(diǎn)：pH范圍2-11.5。使用有機(jī)緩沖液，濃度以10-50mM為好。在中高pH下避免使用磷酸鹽，碳酸鹽緩沖液，最高操作溫度60℃，最佳溫度﹤40℃。分離堿性物質(zhì)，所用流動(dòng)相pH值應(yīng)高于被測(cè)物pKa一個(gè)單位。3-3高效液相色譜

柱pH范圍最高溫度

SBC1890℃C860℃C360℃

苯基60℃

腈基60℃XDB60℃Extend-C1860℃123456789101112ZORBAXRP-HPLC系列柱的使用條件3-3高效液相色譜色譜柱使用與保存所有色譜柱使用緩沖液后必須用柱體積20-30倍的水沖洗色譜柱色譜柱柱體積沖洗體積150×4.6mm2.5ml50ml200×4.6mm3.3ml65ml250×4.6mm4.2ml80ml3-3高效液相色譜色譜柱失效癥狀色譜柱壓增高峰變寬，拖尾，裂峰塔板數(shù)下降，選擇性下降，分離度降低保留值減小或增大色譜柱失效的原因進(jìn)口濾片堵塞、吸附了樣品雜質(zhì)柱填充不良,使用久,機(jī)械及熱沖擊造成空洞固定相遭化學(xué)侵蝕3-3高效液相色譜強(qiáng)保留樣品組分——強(qiáng)吸附組分易聚集在柱進(jìn)口填料上，嚴(yán)重縮短色譜柱壽命。尤其是生物樣品提取物、含油成分等。當(dāng)嚴(yán)重拖尾峰出現(xiàn)時(shí)往往是強(qiáng)保留污染物在柱口處聚集的信號(hào)。色譜柱柱壓升高的原因解決辦法使用保護(hù)柱可延長(zhǎng)分析柱壽命。每天實(shí)驗(yàn)后應(yīng)用強(qiáng)溶劑（例甲醇-水等，至少20-30倍柱體積的量）沖洗色譜柱。并定期進(jìn)行保養(yǎng)，以低流速的強(qiáng)溶劑較長(zhǎng)時(shí)間沖洗色譜柱。3-3高效液相色譜Question1注意！

一旦柱壓升高，應(yīng)停止測(cè)定，用水沖洗數(shù)小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間，待壓力下降后再測(cè)定，如果不清楚堵在哪一段，則應(yīng)逐級(jí)檢查，換泵頭上濾芯，保護(hù)柱等。3-3高效液相色譜檢測(cè)器紫外檢測(cè)器可變波長(zhǎng)檢測(cè)器光電二極管陣列檢測(cè)器示差檢測(cè)器電化學(xué)檢測(cè)器蒸發(fā)光散射熒光檢測(cè)器質(zhì)譜3-3高效液相色譜色譜圖minH光譜圖nm