生物技術-基因工程原理課件 第三章 核酸的分離純化

第三章核酸的分離純化

Chapter3Extraction&PurificationofNucleicAcid12/29/20241第一節(jié)核酸的分離純化12/29/2024212/29/20243一、核酸分離、純化原則保持核酸分子一級結構的完整性防止核酸的生物降解二、分離提取核酸的主要步驟細胞的破碎核蛋白的解聚、變性蛋白的去除核酸的沉淀核酸的濃度測定核酸的保存12/29/20244核酸(nucleicacid)是遺傳信息的攜帶者，是基因表達的物質基礎。無論是進行核酸結構還是功能研究，首先需要對核酸進行分離和純化。核酸樣品質量將直接關系到實驗的成敗。前言12/29/20245一、核酸分離、純化原則(一)保持核酸分子一級結構的完整性

1意義遺傳信息全部儲存在一級結構之中，核酸的—級結構還決定其高級結構的形式以及和其他生物大分子結合的方式。

2分離核酸原則：溫度不要過高；控制一定的pH值范圍(pH值5-9);保持一定的離子強度;減少物理因素對核酸降解的機械剪切力。12/29/20246(二)防止核酸的生物降解細胞內(nèi)或外來的各種核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，破壞核酸一級結構。所用器械和一些試劑需高溫滅菌，提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑。12/29/202471DNA酶抑制劑1）金屬離子螯合劑：

DNA酶需要金屬二價離子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金屬二價離子螯合劑，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2等。2）陰離于型表面活性劑：如SDS，該試劑除對核酸酶有抑制作用外，還能使蛋白質變性，并與變性蛋白結合成帶負電荷的復合物，該復合物在高鹽溶液中沉淀。12/29/202482RNA酶(RNase)抑制劑

RNAase分布廣泛，極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸、耐堿，不宜失活。常用的RNase抑制劑有：(1)皂土(bentonite)

作用機制：皂土帶負電荷，能吸附RNase，使其失活。12/29/20249(2)DEPC(二乙基焦碳酸鹽)(C2H5OCOOCOOC2H5)粘性液體，很強的核酸酶抑制劑。作用機制：與蛋白質中His結合使蛋白變性。使用注意：DEPC也能破壞單鏈核酸中大部分腺嘌呤環(huán)。但濃度比使蛋白質變性的濃度大100～1000倍。容易降解，保存在4℃或液氮中；提RNA時，0.1%DEPC浸泡器皿37℃2h。劇毒。12/29/202410(3)肝素(4)復合硅酸鹽(Macaloid)(5)RNase阻抑蛋白(RNasin)(6)氧釩核糖核苷復合物(Vanadyl-RibonucleosideComplex,VRC)其它RNA酶抑制劑12/29/202411二分離提取核酸的主要步驟(一)細胞的破碎高速組織搗碎機搗碎玻璃勻漿器勻漿超聲波處理法液氮研磨法化學處理法(SDS、吐溫80等)生化法(溶菌酶、纖維素酶等)12/29/202412(二)核蛋白的解聚、變性蛋白的去除

核酸與蛋白質的結合力主要是正負靜電吸力(核酸與堿性蛋白的結合)、氫鍵和非極性的范德華力。分離核酸最困難的是將與核酸緊密結合的蛋白質分開，同時避免核酸降解。12/29/202413常用DNA提取方法：1加入10倍體積的緩沖液：10mMTris-HCl(pH7.4)；150mMNaCl;10mMEDTA;0.5%SDS。NaCl破壞核酸-蛋白質間的靜電引力，使氫鍵破壞，核蛋白解聚；EDTA破壞細胞膜、敖合Ca2+，使DNase失活；

SDS可破壞細胞膜、抑制核酸酶，還可使核酸從蛋白質上游離出來。12/29/2024142加入蛋白酶K，蛋白酶K是一種非特異性蛋白酶。它可將蛋白質消化成氨基酸。一般工作濃度是50～100μg/ml。反應時間>5小時，反應溫度55C。12/29/202415

3酚/氯仿抽提酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并對核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有機相與水相分層，減少殘留在水相中的酚，同時氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液時，需要充分混勻，為防止起泡和促使水相與有機相的分離，再加上一定量的異戊醇(酚：氯：異戊醉=25：24：1)。12/29/202416酚通常是透明無色的結晶，如果酚結晶呈現(xiàn)粉紅色或黃色，表明其中含有酚的氧化產(chǎn)物，例如醌、二酸等。變色的酚不能用于核酸抽提實驗，因為氧化物可破壞核酸的磷酸二酯鍵。酚具有很強的結合水的能力，因此在使用前需要用pH8的10mMTris-HCl飽和后，加入抗氧化劑

-巰基乙醇和8羥基喹啉。酚腐蝕性很強，并可引起嚴重的灼傷，操作時應戴手套。使用酚時應注意12/29/202417RNA提取時的注意事項RNA的提取多采用強變性劑，如異硫氰酸胍等。它不僅可以裂解細胞同時可以有效抑制RNase的活性。由于RNase無處不在，所以在進行RNA操作時應預防RNase的污染。如帶一次性手套、高溫烘烤玻璃器皿、DEPC處理液體和塑料制品等。酚用水飽和。12/29/202418帶Poly(A)+RNA的分離原理：真核生物的mRNA的特點方法：Oligo(dT)-纖維柱磁珠標記的Oligo(dT)12/29/202419(三)核酸的沉淀沉淀是濃縮核酸最常用的方法。優(yōu)點：①改變核酸的溶解緩沖液；②重新調整核酸的濃度；③去除溶液中某些鹽離子與雜質。12/29/2024201DNA沉淀的鹽類及濃度鹽貯存液濃度（mol/L)終濃度(mol/L)MgCl210.01NaAc3(pH5.2)0.3KAc3(pH5.2)0.3NH4Ac102.5NaCl50.2LiCl80.812/29/2024212有機沉淀劑

(1)乙醇優(yōu)點：對鹽類沉淀少，沉淀中所含跡量乙醇易揮發(fā)除去。缺點：需要量大(2～3倍體積)。12/29/202422(2)異丙醇優(yōu)點：需體積小，速度快，適于濃度低、體積大的DNA樣品沉淀。一般不需低溫長時間放置。缺點：易使鹽類、蔗糖與DNA共沉淀．異丙醇難以揮發(fā)除去。12/29/202423(3)聚乙二醇(PEG)優(yōu)點：可用不同濃度的PEG選擇沉淀不同相對分子質量的DNA片段。應用6000相對分子質量的PEG進行DNA沉淀時，使用濃度與DNA片段的大小成反比。注意：

PEG沉淀一般需要加入0.5mol/L的NaCl或10mmol/L的MgCl2。12/29/202424(4)精胺(spermine)精胺不是有機溶劑，但可快速有效沉淀DNA。原理是：精胺與DNA結合后，使DNA在溶液中結構凝縮而發(fā)生沉淀，并可使單核苷酸和蛋白質雜質與DNA分開，達到純化DNA的目的。12/29/2024253核酸沉淀的溫度和時間核酸沉淀應該在低溫下長時間進行。若溶液中核酸濃度很高，在鹽離子存在的情況下，加入異丙醇等后即可看到DNA的絮狀沉淀。若溶液中核酸濃度很低，則需在－20C下過夜。酵母tRNA可有助nanogram級的核酸沉淀。大于10g/ml的核酸，冰浴10分鐘即可有效沉淀。12/29/202426(四)核酸的濃度測定1紫外分光光度法測定核酸的含量在波長260nm紫外光下，1OD值的吸光度相當于雙鏈DNA濃度為50μg/ml；單鏈DNA和RNA為40μg/ml；寡核苷酸為35μg/ml。需要注意的是OD值范圍應該在0.1～0.99之間，否則不符合上述線性關系。12/29/202427(五)核酸的保存1DNADNA樣品溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃或加1滴氯仿-70℃可保存數(shù)年。2RNARNA樣品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)加入2倍體積的乙醇中，-70℃保存;②在RNA溶液中，加1滴氯仿或0.2mol/LVRC(氧釩核糖核苷復合物)凍貯于-70℃,可保存數(shù)年。12/29/202428第三節(jié)核酸分子雜交技術

具有互補序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補配對原則退火形成雙鏈的過程。

雜交的雙方是待測核酸和已知核酸序列，已知核酸序列稱探針。雜交有固一液相雜交和液相雜交。

一、核酸分子雜交的基本原理12/29/202429變性復性

DNA-DNA雜交雙鏈分子二、DNA變性與復性(一)、DNA變性

1、定義：某些理化因素導致兩條DNA鏈間的氫鏈斷裂變?yōu)閱捂湹倪^程，稱DNA變性12/29/2024302、變性的方法：（1）熱變性：溫度升高到90~100℃時，雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵完全斷裂。（2）酸堿變性：pH值低于3或高于10時，雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。（3）化學試劑變性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。12/29/2024313、變性后的理化性質變化：粘度降低密度增加紫外吸收值增加12/29/2024324、DNA變性曲線

AT區(qū)先解鏈

GC區(qū)后解鏈階梯式曲線12/29/2024335、GC含量與Tm值之間的關系（G+C）%=（Tm-69.3)×2.44Tm=(G+C)%×0.41+69.312/29/202434(二)復性

1、定義：變性的單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補原則重新結合為雙鏈核酸的過程，稱復性或雜交。具有互補序列的兩條單鏈核酸都可互補形成雙鏈：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。12/29/2024352、復性過程單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈局部雙鏈周圍的堿基如不配對時，雙鏈重新解離局部雙鏈周圍的堿基如配對，則形成中心序列形成完整的雙鏈分子12/29/202436二、影響雜交的因素

1、核酸分子的濃度和長度：濃度越大，復性速度越快分子越大，復性速度越慢單鏈探針，濃度增加，雜交效率增加雙鏈探針，濃度控制在0.1~0.5μg，濃度過高影響雜交效率12/29/2024372、溫度：（1）DNA/DNA雜交，適宜溫度較Tm值低20~25℃

（2）RNA/DNA或RNA/RNA雜交，加甲酰胺降低

Tm值（3）用寡核苷酸探針雜交，適宜溫度較Tm值低5℃12/29/2024383、離子強度：低鹽濃度時雜交率較低，隨著鹽濃度增加，雜交率增加高濃度的鹽使堿基錯配的雜交體更穩(wěn)定，當進行序列不完全同源的核酸分子雜交時，必須維持雜交反應液中較高的鹽濃度和洗膜溶液的鹽濃度

12/29/2024394、甲酰胺：甲酰胺能降低核酸雜交的Tm值，能降低雜交液的溫度，低溫時探針與待測核酸雜交更穩(wěn)定，當待測核酸與探針同源性不高時，加50%甲酰胺溶液在35~42℃雜交如待測核酸序列與探針同源性高時，則用水溶液在68℃雜交

12/29/2024405、核酸分子的復雜性：核酸的復雜性是指存在于反應體系中不同順序的總長度Cot?與反應體系中核酸復雜性成正比兩個DNA樣品濃度絕對一致時，變性后的相對雜交率取決于DNA的相對復雜性12/29/2024416、非特異性雜交反應：雜交前封閉非特異性雜交位點，減少其對探針的非特異性吸附常用的封閉物有兩類：即非特異性DNA和高分子化合物。如鮭魚精子DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脫脂奶粉

12/29/202442第二節(jié)核酸分子雜交的方法按待測核酸是否固定在固相支持物上分：

固-液相雜交膜上印跡雜交原位雜交液相雜交

RNA酶保護分析法核酸酶S1保護分析法

12/29/202443一、Southern印跡雜交（一）待測核酸樣品的制備

1、裂解或破碎細胞

2、抽取純化基因組DNA3、限制酶消化DNA為大小不同的DNA片段12/29/202444(二)待測DNA樣品的電泳分離

1、瓊脂糖濃度：分離大片段用低濃度膠分離小片段用高濃度膠

2、凝膠電泳：凝膠具有分子篩效應，大分子

DNA泳動慢,小分子DNA泳動快，大小相同的分子處于同一條帶

3、分子量標準：經(jīng)HindⅢ消化的λDNA，雜交所用分子量標準可用核素標記12/29/202445(三)凝膠中核酸的變性(堿變性)凝膠置于NaOH溶液中使DNA變性為單鏈

DNA,中性緩沖液中和凝膠中的緩沖液。使用稀HCl使DNA脫嘌呤，這樣可以讓DNA片段變短，提高轉移效率。12/29/202446(四)Southernblotting(印跡)指將電泳分離的DNA片段轉移到一定的固相支持物上的過程12/29/2024471、固相支持物的選擇(1)理想的固相支持物應具備的特性①具有較強結合核酸分子的能力②不影響與探針的雜交反應③與核酸分子結合穩(wěn)定牢固④具有良好的機械性能

非特異吸附少12/29/202448(2)常用的固相支持物①硝酸纖維素膜：優(yōu)點是吸附能力強，雜交信號本底低。缺點是DNA分子結合不牢固②尼龍膜：優(yōu)點是結合單鏈，雙鏈DNA的能力比硝酸纖維素膜強；缺點：雜交信號本底高③化學活化膜：優(yōu)點：DNA與膜共價結合；對不同大小的DNA片段有同等結合能力；缺點：結合能力較上述兩種膜低12/29/2024492、Southern印跡的常用方法

(1)毛細管虹吸印跡法利用濃鹽轉移緩沖液的推動作用，將凝膠中的DNA轉移到固相支持物上。12/29/202450基本原理：容器中的轉移緩沖液含有高濃度的NaCl和檸檬酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過濾紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運動，同時帶動凝膠中的DNA片段垂直向上運動，凝膠中的DNA片段移出凝膠而滯留在膜上。12/29/202451(2)電轉法利用電場的電泳作用將凝膠中的DNA轉移到固相支持物上。12/29/202452(3)真空轉移法此法原理與毛細管虹吸法相同，只是以濾膜在下，凝膠在上的方式將其放置在一個真空室上，利用真空作用將轉膜緩沖液從上層容器中通過凝膠和濾膜抽到下層真空室中，同時帶動核酸片段轉移到凝膠下面的尼龍膜或硝酸纖維素膜上。12/29/202453

(五)Southern雜交

1、預雜交：封閉膜上能與DNA結合的位點預雜交液為不含DNA探針的雜交液

2、雜交：液相中的DNA探針與膜上的待測DNA雜交雙鏈DNA探針需加熱變性為單鏈，再雜交

3、洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結合的DNA

12/29/202454(六)雜交結果檢測

1、放射自顯影：適用于放射性核素標記的探針

2、比色或化學發(fā)光檢測：適于非核素標記的探針12/29/20245512/29/202456(七)Southernblotting的應用

1、酶切圖譜分析

2、特定基因定性和定量

3、基因突變分析

4、限制性片段長度多態(tài)性的分析12/29/202457二、Northern

blotting雜交

1、基本原理和基本過程與Southernblot基本相同

2、對待檢樣品中mRNA的長度和豐度進行分析

3、探針可用DNA或RNA片段

4、待測樣品為總RNA或mRNA12/29/202458Northern與Southernblotting的不同點

1、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時加變性劑保持RNA處于變性狀態(tài)，DNA電泳前和電泳中不變性

2、轉膜：RNA轉膜前不需變性和中和處理,Southern印跡時，DNA轉膜前需進行堿變性及中和處理

3、靶核酸為RNA12/29/202459三、斑點及狹縫印跡雜交

1、斑點印跡為圓形

2、狹縫印跡為線狀

3、鑒別DNA、RNA4、簡單、快速，同一張膜可檢測多個樣品

5、特異性不高、不能鑒別核酸分子量12/29/202460四、原位雜交(insituhybridization)

1、定義：將標記的核酸探針與固定在細胞或組織中的核酸進行雜交，稱原位雜交。根據(jù)檢測物分細胞內(nèi)原位雜交和組織切片內(nèi)原位雜交；根據(jù)探針與待檢核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA雜交12/29/202461保持組織細胞的形態(tài)對核酸無抽提，修飾與降解作用不改變核酸在組織細胞內(nèi)的定位不阻礙核酸與探針的雜交過程對雜交信號無遮蔽作用理化性質穩(wěn)定2、雜交過程：(1)組織或細胞的固定理想固定液應具備：什么最好？多聚甲醛12/29/202462(2)組織細胞雜交前的預處理去垢劑(如Tritonx-100和SDS)和蛋白酶K去除核酸表面的蛋白質組織細胞內(nèi)的核酸與蛋白質結合成核酸蛋白復合體控制消化時間，避免細胞結構破壞和核酸從載玻片上脫落12/29/202463(3)探針的選擇與標記以獲得最好雜交效果為依據(jù)選擇探針探針的長度一般為50~300bp,有時達1.5kb

放射性核素標記探針敏感性高，操作簡便穩(wěn)定檢測結果分辨率高，但信號檢測時間長

非核素標記探針安全、穩(wěn)定性好、顯色快，易于觀察12/29/202464(4)雜交雜交液體積?。?0~20μl

cDNA和RNA探針雜交溫度約為50℃

雜交時間:DNA探針雜交為2~4h,RNA探針雜交過夜

雜交前一般將組織切片置95℃5~15分鐘使DNA變性沖洗溫度一般不超過50℃12/29/202465(5)雜交結果檢測所用探針為核素標記,放射自顯影檢測

所用探針為非核素標記,比色或化學發(fā)光檢測12/29/202466端粒原位雜交圖12/29/202467五、液相雜交指待測核酸和探針都存在于雜交液中，堿基互補的單鏈核酸分子在液體中配對形成雜交分子的過程。12/29/202468(一)RNA酶保護分析法1、RNA酶保護分析法原理RNaseA和RNaseT1專一水解雜交體系中的單鏈RNA，不水解探針RNA與待測RNA互補形成的雙鏈RNA，使雜交分子得到保護，稱RNA酶保護分析法。12/29/2024692、雜交過程

制備待測RNARNA探針的制備與標記：體外轉錄法制備和標記RNA探針雜交：待測RNA與RNA探針在液相中雜交

RNaseA和RNaseTI除去單鏈RNA

電泳分離RNA

放射自顯性檢測雜交結果12/29/202470(二)核酸酶S1保護分析法

1、原理核酸酶S1在一定條件下專一水解雜交體系中的單鏈DNA和單鏈RNA，不水解DNA探針與待測RNA雜交形成的雜交體，使雜交分子得到保護，稱核酸酶S1保護分析法12/29/2024712、雜交過程制備待測RNA：總RNA或mRNA均可單鏈DNA探針的制備與標記雜交：單鏈DNA探針與待測RNA在液相中雜交核酸酶S1除去單鏈DNA和單鏈RNA

電泳分離DNA/RNA雜交體分子放射自顯影檢測雜交結果12/29/202472第三節(jié)探針的標記一、探針的種類

基因組DNA探針

cDNA探針

RNA探針

寡核苷酸探針12/29/202473二、標記物

(一)理想標記物應具備的特性：

高度靈敏性不影響堿基配對的特異性不影響探針分子的主要理化性質對酶促反應活性無影響或影響不大檢測方法具有高度靈敏性和高度特異性12/29/202474(二)標記物種類核素標記物：32p、35s、3H

非核素標記物半抗原：生物素、地高辛配體：生物素是親和素的配體熒光素：異硫氰酸熒光素、羅丹明等化學發(fā)光探針：標記物與某種底物反應發(fā)光，如生物素?；膲A性磷酸酶可使發(fā)光底物發(fā)光

12/29/202475三、標記方法

體內(nèi)標記法：將核素標記的化合物作為合成代謝的底物，在細胞合成代謝時使核素摻入到新合成的核酸分子中，如3H-胸苷可摻入到DNA中，3H-尿苷可摻入到RNA中

12/29/202476體外標記法：

化學標記法：標記物分子上的活性基因與