高三一輪復(fù)習(xí)生物【知識(shí)精研】基因工程課件

第54講

基因工程的基本工具和基本操作程序1.基因工程的概念？操作水平？原理？優(yōu)點(diǎn)？2.DNA重組技術(shù)的三種工具及其作用？3.DNA粗提取的原理？DNA鑒定的原理？4.基因工程的四個(gè)步驟？導(dǎo)入的方法有哪些？檢測與鑒定的方法？5.PCR的全稱、原理、條件、過程？如何用電泳鑒定PCR結(jié)果？第53講胚胎工程回歸課本：第3章第1、2節(jié)P67-86第55講基因工程的應(yīng)用和蛋白質(zhì)工程回歸課本：第3章第3、4節(jié)P87-98核心知識(shí)：目的基因基因重組受體分子遺傳性狀基因工程的概念P67基因工程得以實(shí)現(xiàn)的理論基礎(chǔ)是？拓展基因工程的理論基礎(chǔ)蘇云金桿菌與載體拼接普通棉花（無抗蟲特性）棉花細(xì)胞抗蟲棉提取表達(dá)Bt基因?qū)隑t基因重組DNA分子基因工程的實(shí)現(xiàn)需要解決哪些問題？1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的

檢測與鑒定如何篩選和獲取目的基因？需要什么工具？為何要拼接？如何拼接？需要什么工具？將目的基因?qū)氩煌锛?xì)胞的方法基因表達(dá)載體在結(jié)構(gòu)上需具備哪些條件？P80目的基因一定能進(jìn)入受體細(xì)胞嗎？進(jìn)入受體細(xì)胞后一定能表達(dá)嗎？工具工具酶分子運(yùn)輸車：

。（１）

。（２）

。ＤＮＡ連接酶載體【注意】工具≠工具酶質(zhì)粒噬菌體動(dòng)植物病毒“手術(shù)刀”“縫合針”一、重組DNA技術(shù)的基本工具限制性內(nèi)切核酸酶，簡稱限制酶1.限制酶原核生物數(shù)千特定核苷酸序列磷酸二酯鍵黏性末端一、重組DNA技術(shù)的基本工具1、原核生物中存在限制酶的意義是什么？P71“旁欄思考”：原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保證自身安全，防止外來病原物的危害。2、限制酶來源于原核生物，為什么不能切割自己的DNA分子？限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在該酶的識(shí)別序列或識(shí)別序列已經(jīng)被修飾?；A(chǔ)過手3、突破：用限制酶切割時(shí)需注意的事項(xiàng)——①獲取一個(gè)目的基因需限制酶切割

次,共產(chǎn)生

個(gè)游離的磷酸基團(tuán)②獲取目的基因和切割載體時(shí),通常使用同種限制酶,目的是

。但是使用該法缺點(diǎn)是容易發(fā)生

，為了避免上述情況發(fā)生，可采取的措施是

。為了產(chǎn)生相同的黏性末端，便于連接兩4使用兩種不同的限制酶同時(shí)去切割目的基因和載體目的基因、質(zhì)粒的自身環(huán)化以及目的基因與質(zhì)粒反向連接基礎(chǔ)過手限制酶如何選擇呢？“限制酶”的選擇例1.①用圖1中的質(zhì)粒和圖2中的外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是

。SmaⅠ會(huì)破壞質(zhì)粒中的抗性基因以及破壞目的基因“限制酶”的選擇例2.如圖是培育表達(dá)人乳鐵蛋白的乳腺生物反應(yīng)器的技術(shù)路線用圖2中的人乳鐵蛋白目的基因和圖1所示的質(zhì)粒構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，選用的限制酶是

（從“EcoRⅠ”、“BamHⅠ/HindⅢ”、“SmaⅠ/HindⅢ”中選擇）．不能選擇其他限制酶的理由分別是：

。BamHⅠ/HindⅢ若選EcoRⅠ會(huì)破壞質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)，單酶切還會(huì)導(dǎo)致目的基因、載體的自身環(huán)化，以及反向連接若選SmaⅠ/HindⅢ，則構(gòu)建的重組質(zhì)粒沒有標(biāo)記基因或復(fù)制原點(diǎn)②不能破壞目的基因序列；①不能破壞啟動(dòng)子、終止子、抗性基因、復(fù)制原點(diǎn)等特殊序列；小結(jié)：“限制酶”的選擇③為避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接，可采用雙酶切；④確保出現(xiàn)相同黏性末端原則：無同源酶時(shí)可替代選擇同尾酶（識(shí)別序列完全一致，但能產(chǎn)生相同的黏性末端）2.DNA連接酶P72磷酸二酯鍵大腸桿菌黏性末端黏性末端分子縫合針一、重組DNA技術(shù)的基本工具只是連接平末端的效率相對較低小結(jié)：DNA連接酶與DNA聚合酶的比較：相同點(diǎn)——都是催化形成磷酸二酯鍵不同點(diǎn)——DNA聚合酶DNA連接酶DNA連接酶DNA聚合酶：將單個(gè)核苷酸連接到DNA片段上DNA連接酶：DNA片段與DNA片段噬菌體有一個(gè)至多個(gè)自我復(fù)制受體DNA標(biāo)記☆☆最常用的載體——質(zhì)粒，它是裸露的（表面無蛋白質(zhì)）、可存在于真核細(xì)胞核以外或原核擬核之外，并有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。3.載體經(jīng)人工改造1.在基因工程中，已知限制酶Ⅰ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—↓GATC—。根據(jù)下圖示判斷下列操作錯(cuò)誤的是()A.質(zhì)粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割B.用限制酶切割獲得目的基因時(shí)，有四個(gè)磷酸二酯鍵被水解C.限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割后獲得的黏性末端相同D.質(zhì)粒中標(biāo)記基因便于篩選出目的基因已經(jīng)表達(dá)的細(xì)胞D基礎(chǔ)過手做題技巧：選項(xiàng)看完，D明顯錯(cuò)，是篩選含有目的基因的細(xì)胞都產(chǎn)生GATC——若用酶II則質(zhì)粒的兩個(gè)標(biāo)記基因都被破壞若用酶I則目的基因只能切開左端2.某線性DNA分子含有3000個(gè)堿基對(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的產(chǎn)物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表所示。限制酶a和b的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)如圖所示。下列有關(guān)說法正確的是()a酶切割產(chǎn)物(bp)b酶再次切割產(chǎn)物(bp)1600；1100；300800；300A.在該DNA分子中，a酶與b酶的識(shí)別序列分別有3個(gè)和2個(gè)B.a酶與b酶切出的黏性末端不能相互連接C.a酶與b酶切斷的化學(xué)鍵不相同D.用這兩種酶和DNA連接酶對該DNA分子進(jìn)行反復(fù)切割、連接操作，若干循環(huán)后，D序列會(huì)明顯增多a、b酶識(shí)別序列不同，但切出的黏性末端相同——叫同尾酶，可以相互連接，B錯(cuò)；C也明顯a酶將線狀DNA切成3段，說明有2個(gè)識(shí)別序列b酶將1600切成800+800，將1100切成800+300，說明有2個(gè)識(shí)別序列2.實(shí)驗(yàn)原理：（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精。（2）DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/LNaCl溶液。（3）在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色。00.14NaCI濃度（mol/L）DNA溶解度1.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路：DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)方法去除其他成分，對DNA進(jìn)行提取。二、DNA的粗提取與鑒定P74DNA含量相對較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等。不能選擇哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞，因?yàn)椴溉閯?dòng)物成熟的紅細(xì)胞中沒有細(xì)胞核和線粒體，幾乎不含DNA。3.選材：4.試劑：①研磨液②體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺試劑⑤蒸餾水——含有NaCl、SDS和HCl——析出DNA——溶解DNA——鑒定DNA，要現(xiàn)配現(xiàn)用二、DNA的粗提取與鑒定P74冷酒精析出DNADNA的鑒定（沸水浴、二苯胺）研磨稱取約30g洋蔥切碎，放入研缽中，倒入10mL研磨液，充分研磨。紗布過濾取上清液在漏斗中墊上紗布，將洋蔥研磨液過濾到燒杯中，在4℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液。也可將研磨液直接離心在上清液中加入體積相等的、預(yù)冷的酒精溶液(體積分?jǐn)?shù)為95%)，靜置2～3min，溶液中出現(xiàn)的白色絲狀物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分；取兩支試管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。將絲狀物溶于其中一試管NaCl溶液中。然后，另一試管為空白對照，向兩支試管中各加入4mL的二苯胺試劑。混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min。二、DNA的粗提取與鑒定P74①以血液為實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，每100mL血液中需要加入3g檸檬酸鈉，防止血液凝固。②利用動(dòng)物細(xì)胞提取DNA破碎細(xì)胞的方法：動(dòng)物細(xì)胞無細(xì)胞壁，可直接吸水漲破。③加入研磨液后，必須充分研磨，否則細(xì)胞核不會(huì)充分破碎，釋放出的DNA量就會(huì)減少。④加入酒精和用玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。⑤預(yù)冷的酒精具有以下優(yōu)點(diǎn)：a.可抑制DNA酶的活性，進(jìn)而抑制DNA降解；b.抑制分子運(yùn)動(dòng)，使DNA易形成沉淀析出；c.低溫有利于增加DNA分子的柔韌性，減少其斷裂。注意事項(xiàng)二、DNA的粗提取與鑒定P741、篩選合適的目的基因的方法有——

①從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)與功能清晰的基因中進(jìn)行篩選是較為有效的方法之一。②利用序列數(shù)據(jù)庫（GenBank）和序列比對工具(BLAST)進(jìn)行篩選。第一步

目的基因的篩選與獲取明確目的基因后，怎么獲取它呢？可以人工合成目的基因，比如逆轉(zhuǎn)錄法——思考：通過逆轉(zhuǎn)錄法得到的cDNA片段相比于直接從真核細(xì)胞中酶切獲得的目的基因片段，在基因結(jié)構(gòu)上有何區(qū)別？真核生物的目的基因本身包含內(nèi)含子,而由成熟mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成的目的基因片段只含外顯子，無內(nèi)含子。這會(huì)有什么好處呢？1、篩選合適的目的基因第一步

目的基因的篩選與獲取在真核生物中，轉(zhuǎn)錄后的原始mRNA（pre-mRNA）需要經(jīng)過剪接，將基因的內(nèi)含子對應(yīng)轉(zhuǎn)錄出的序列切除，將外顯子對應(yīng)轉(zhuǎn)錄出的序列連接起來，形成成熟的mRNA，才能進(jìn)而翻譯出蛋白質(zhì)。原核生物沒有真核細(xì)胞特有的mRNA剪接加工機(jī)制，因此如果直接將酶切獲得的真核生物的基因本身導(dǎo)入原核生物，導(dǎo)致無法加工形成成熟mRNA，無法正確表達(dá)。而使用逆轉(zhuǎn)錄合成出的cDNA不含有內(nèi)含子，就可以直接導(dǎo)入到原核細(xì)胞內(nèi)，并在原核生物中正確表達(dá)。2、利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因科學(xué)家人工合成了目的基因，常用PCR特異性地快速擴(kuò)增目的基因逆轉(zhuǎn)錄法人工合成胰島素基因？快速獲得大量胰島素基因2、利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因結(jié)合體內(nèi)DNA復(fù)制過程，思考PCR的進(jìn)行需要哪些條件？PCR——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）DNA模板引物（2種）穩(wěn)定的緩沖溶液（一般添加Mg2+）四種脫氧核苷酸(實(shí)際加入的一般是4種dNTP，水解2個(gè)磷酸后獲得脫氧核苷酸)激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶條件P77☆引物的作用：使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸2、利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因問題：設(shè)計(jì)目的基因的引物時(shí)，需要考慮哪些方面的因素呢？②在引物的5’端上游加入適當(dāng)?shù)南拗菩悦缸R(shí)別序列（便于和被同種限制酶切割后的載體相結(jié)合）第一步

目的基因的篩選與獲?、倌康幕虻?’端序列（因?yàn)镈NA聚合酶不能從頭合成DNA）DNA模板①變性：加熱至90℃以上使雙鏈解聚為單鏈②復(fù)性:冷卻至50℃左右，2種引物與DNA結(jié)合引物③延伸:上升到72℃，DNA合成+耐高溫的DNA聚合酶+dATP+dGTP+dCTP+dTTP第一輪的產(chǎn)物,又可作為下一個(gè)循環(huán)模板①變性90℃以上②復(fù)性③延伸冷卻加熱50℃左右引物模板結(jié)合72℃左右DNA從5’端到3’端延伸。72℃時(shí)，2、利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因過程易錯(cuò)提醒PCR擴(kuò)增過程中的循環(huán)圖示與規(guī)律①1個(gè)模板DNA分子經(jīng)過n輪PCR，可以擴(kuò)增出

個(gè)DNA片段，共需要引物數(shù)量為

。②1個(gè)模板DNA分子經(jīng)過

輪PCR，可以擴(kuò)增出僅含目的基因的片段，定量規(guī)律：

。

2n2n＋132n-2n－2(2020·北京)為了對重金屬污染的土壤進(jìn)行生物修復(fù)，研究者將從楊樹中克隆的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(HMA3)基因與外源高效啟動(dòng)子連接，導(dǎo)入楊樹基因組中(如圖)。為檢測獲得的轉(zhuǎn)基因楊樹苗中是否含有導(dǎo)入的HMA3基因，同時(shí)避免內(nèi)源HMA3基因的干擾，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)選擇的引物組合是A.①＋③ B.①＋②C.③＋② D.③＋④B高考練兵需要檢測高效啟動(dòng)子是否和HMA3基因連接著導(dǎo)入了楊樹細(xì)胞(1)基因表達(dá)載體的目的①使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，且可以遺傳給下一代；②使目的基因能夠在受體細(xì)胞中表達(dá)和發(fā)揮作用。(2)基因表達(dá)載體的組成位置：功能：RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)。目的基因的上游（一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，緊挨轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)）人們所需要的基因位置：功能：基因的下游3’端（一段特殊的DNA片斷）終止mRNA的轉(zhuǎn)錄如抗性基因，用來鑒別或篩選含有重組DNA分子的細(xì)胞第二步基因表達(dá)載體的構(gòu)建還可人工構(gòu)建誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)可激活或抑制基因表達(dá)(3)基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程基因表達(dá)載體構(gòu)建模式圖第二步基因表達(dá)載體的構(gòu)建單酶切缺點(diǎn)?A.目的基因自身環(huán)化B.質(zhì)粒重新環(huán)化C.質(zhì)粒與目的基因反向連接通過雙酶切法解決這些問題將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法花粉管通道法——顯微注射法——Ca2+處理法我國科學(xué)家獨(dú)創(chuàng),培育出了抗蟲棉第三步將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞(1)花粉管通道法②在植物授粉后一定時(shí)間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通過花粉管通道進(jìn)入胚囊。①用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；第三步將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞(植物)(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法示意圖Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建基因表達(dá)載體含目的基因的重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞目的基因插入植物染色體DNA中植物細(xì)胞表現(xiàn)出新性狀的植株植物組織培養(yǎng)將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T-DNA中，通過農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，使目的基因進(jìn)入植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化：指目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)的過程。操作程序：取受精卵顯微注射胚胎移植為什么常選用受精卵作為受體細(xì)胞呢？提純基因表達(dá)載體①體積大，易操作。②全能性高，易培養(yǎng)成完整個(gè)體。第三步將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞(動(dòng)物)——顯微注射法方法——使用Ca2+處理：可使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)。P82過程Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞基因表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子大腸桿菌細(xì)胞注意：原核生物沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體，它作為受體細(xì)胞產(chǎn)生出的真核生物蛋白質(zhì)通常沒有生物活性，需要在體外進(jìn)行再加工。第3步將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞(微生物)微生物作為受體細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)：繁殖快，單細(xì)胞，遺傳物質(zhì)相對較少，易于培養(yǎng)操作類型步驟檢測內(nèi)容方法分子檢測第一步轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因PCR等技術(shù)第二步目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNAPCR等技術(shù)第三步目的基因是否翻譯形成蛋白質(zhì)抗原-抗體雜交技術(shù)個(gè)體水平鑒定抗蟲或抗病的接種實(shí)驗(yàn)抗性以及抗性程度

抗性檢測；基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能活性比較

功能活性。第四步目的基因的檢測與鑒定加入相應(yīng)的抗體1、紫花苜蓿是一種重要的牧草。某研究團(tuán)隊(duì)擬將耐鹽基因HAL1導(dǎo)入紫花苜蓿中培育耐鹽牧草。具體實(shí)驗(yàn)流程如圖所示。下列操作錯(cuò)誤的是

(

)A．可選用氯化鈣處理農(nóng)桿菌，有利于重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌B．將農(nóng)桿菌與苜蓿愈傷組織一起培養(yǎng)一段時(shí)間后，往往需要添加適量抗生素抑制農(nóng)桿菌生長C．為確認(rèn)轉(zhuǎn)基因苜蓿是否培育成功，需對苜蓿植株進(jìn)行耐鹽檢測D．耐鹽基因應(yīng)插入T-DNA片段以外，防止破壞T-DNAD基礎(chǔ)過手2.戊型肝炎病毒是一種RNA病毒，ORF2基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白(pORF2)位于病毒表面，構(gòu)成病毒的衣殼。我國科研人員利用基因工程技術(shù)，在大腸桿菌中表達(dá)pORF2，制備戊型肝炎疫苗，過程如圖。下列關(guān)于該疫苗的敘述，正確的是A.過程①需要的酶是RNA聚合酶，原料是

A、U、G、CB.重組基因表達(dá)載體上的啟動(dòng)子需來源于戊型肝炎病毒C.過程⑤需要用聚乙二醇處理大腸桿菌使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中

DNA分子的生理狀態(tài)D.過程⑥大量制備pORF2蛋白前應(yīng)做相應(yīng)的檢測與鑒定D基礎(chǔ)過手①是逆轉(zhuǎn)錄過程大腸桿菌細(xì)胞聯(lián)想：PEG有什么作用？篩選出能成功表達(dá)目的蛋白的大腸桿菌，再進(jìn)行培養(yǎng)1.DNA體外擴(kuò)增的原理PCR利用了DNA熱變性原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合，實(shí)現(xiàn)體外擴(kuò)增。PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器，一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)。PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。2.DNA片段電泳鑒定的原理DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷相反的電極移動(dòng)，這個(gè)過程就是電泳。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)。凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。四、DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定P84-85循環(huán)程序變性復(fù)性延伸預(yù)變性940C，5min30次940C,30s550C,30s720C，1min最后一次940C，1min550C,30s720C，1min用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量移液管中依次加入各組分。（緩沖液、脫氧核苷酸、2種引物、Taq酶、模板DNA）待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子。將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。移液離心擴(kuò)增3.PCR實(shí)驗(yàn)操作步驟注意：預(yù)變性和最后一次循環(huán)時(shí)加熱變性時(shí)間更長根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞?，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。凝膠溶液完全凝固后小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜。將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個(gè)加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物（Marker）。配制瓊脂糖溶液制備凝膠加樣電泳、觀察接通電源，根據(jù)電泳槽陽極至陰極之間的距離來設(shè)定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時(shí)，停止電泳。取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。4.DNA的電泳鑒定1．下列有關(guān)“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的敘述，正確的是()

A．新鮮豬血、菜花等動(dòng)植物材料均可用于DNA的粗提取

B．植物材料需先研磨破碎細(xì)胞

C．DNA只能溶于2mol/L的NaCl溶液

D．溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺試劑后，顏色呈紫色B2．下列關(guān)于PCR操作過程的敘述，錯(cuò)誤的是()

A．PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前須進(jìn)行高壓滅菌

B．PCR利用了DNA的熱變性原理

C．PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后，迅速融化

D．在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換CP85注意事項(xiàng)：緩慢融化—避免破壞緩沖液中穩(wěn)定性較差的成分，同時(shí)保護(hù)酶的活性基礎(chǔ)過手乳腺（房）生物反應(yīng)器器官移植生長五、基因工程的應(yīng)用P87-92（1）乳房（乳腺）生物反應(yīng)器：

①具體做法：將

基因與

等調(diào)控組件重組在一起，通過

方法，導(dǎo)