DB51T 2913-2022 大口黑鱸諾卡氏菌病診斷和防治技術(shù)規(guī)程

DB51SpecificationfordiagnosisandcontrolofPathogenNocardiosisfromMicropterusI 2 2 2 2 2 4 5 5 6 本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定本文件主要起草人：李成偉、耿毅、王均、賀揚(yáng)、吳宏偉、劉海燕、王振華、李建臻、黎1大口黑鱸諾卡氏菌病診斷和防治技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了大口黑鱸（Micropterussalmoides）養(yǎng)殖過(guò)程中發(fā)生的諾卡氏菌病的流行情況、發(fā)GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)GB/T14926.43實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)GB/T27623.1漁用抗菌藥物藥效試驗(yàn)DB51/T526大口黑鱸養(yǎng)殖技術(shù)規(guī)范指由鰤諾卡氏菌（Nocardiaseri4試劑和材料4.1水4.2試劑與培養(yǎng)基革蘭氏染液配制按照GB/T14926.43中1%瓊脂糖凝膠、七葉苷培養(yǎng)基、明膠培養(yǎng)基等相關(guān)配方見(jiàn)附錄A，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、PCR純化24.4特異性鑒定引物特異性鑒定上游引物N5F1：5′-TGAGCCTGAACTGCATGGTTC-3′，下游引物N5R1：5′超凈工作臺(tái)、光學(xué)顯微鏡、PCR儀、電泳儀、離心機(jī)、生化培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱、常規(guī)細(xì)菌接水溫15～32℃時(shí)都可流行，我省在每年4月底開(kāi)始大規(guī)模爆發(fā)，直至10月均有該病流行，25~利用接種環(huán)，劃線接種至BHI固體培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7～12d，從形態(tài)一致的優(yōu)勢(shì)菌群中挑取9細(xì)菌的鑒定9.1形態(tài)學(xué)鑒定9.1.1菌落形態(tài)9.1.2細(xì)菌形態(tài)3革蘭氏染色法染色觀察，參照GB/T14926.43中的9.2生化特性鑒定9.2.1氧化酶試驗(yàn)9.2.2尿素酶試驗(yàn)9.2.3硝酸鹽還原試驗(yàn)9.2.4過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)9.2.5檸檬酸鹽試驗(yàn)9.2.6七葉苷水解試驗(yàn)9.2.7明膠液化試驗(yàn)9.2.8淀粉水解試驗(yàn)按SC/T7014中的規(guī)定執(zhí)行，呈藍(lán)色者為陰性，無(wú)DNA提取采用商品化的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，按說(shuō)明書(shū)操9.3.3瓊脂糖凝膠電泳用1×TAE電泳緩沖液配制1%的瓊脂糖凝膠（含0.5μL/mLEB）平板，凝固后放入水平電泳槽，使泳緩沖液剛好淹沒(méi)膠面。將上述擴(kuò)增產(chǎn)物6μL樣品加入樣品孔，使用DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物作對(duì)照。120V49.3.5測(cè)序與同源性分析9.4特異性檢測(cè)9.4.1特異性基因擴(kuò)增延伸1.5min，循環(huán)擴(kuò)增30次；72℃終延9.4.2序列檢測(cè)++ +5符合以下a）b）c）三條特征的基礎(chǔ)上，d）或者e）特征出現(xiàn)任意一條者判定為大口黑鱸諾卡氏菌b)所分離病原菌菌落與菌體形態(tài)分別與“10.1”和“10.2”相符；放苗前做好清塘工作，使用無(wú)諾卡氏菌污染的水源和水系統(tǒng)，養(yǎng)殖用水符合NY5051中的規(guī)定；購(gòu)入的大口黑鱸苗種經(jīng)檢驗(yàn)檢疫合格，不含諾卡氏菌病原；做好投飼及日常管理工作，參照DB51/T526外用聚維酮碘或戊二醛溶液等漁用消毒藥物全池潑灑，藥物使用應(yīng)符合SC/T16在400mL雙蒸水中溶解121gTris堿，加入28.55mL冰乙酸和50mL0.5mol/LEDTA。再加A.4七葉苷培養(yǎng)基胰蛋白胨5.0g，磷酸二氫鉀1.0g，七葉苷3.0g，檸檬酸鐵銨0.5g，混勻，加熱攪拌溶解，調(diào)節(jié)pH值為7.4±0.2，定容至1000ml，121℃高壓71ttaacacatgcaagtcgagcggtaag61taacacgtgggtgatctgccttgcactctg121ggatatgagcctgaact181gcggcctatcagcttgttggtgaggtaa241tgagagggcgaccggccacactgggactgagacacggccc301agtggggaatattgcacaatgggcgaaagcctgatgca361ggccttcgggttgtaaacctcttt421agaagcaccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgt481cggaatgactgggcgtaaagagcttgtaggcggtctgtcacg541agctcaactgtgggcctgcggtcgatacgggcagacta601attcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggagga661tctctgggaagtaactgacgctgagaagcgaaagcgtggg721cctggtagtccacgccgtaaacggtgggtactaggtgtgg781tgccgtagctaacgcattaagtaccccgcctggggag841aaggaattgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgtggat901aagaaccttacctgggtttgacatacaccggaaagccgta961ggtcggtgtacaggtggtgcatggct1021tcccgcaacgagcgca1081gagactgccggggtcaactcggagg11