(高清版)DB22∕T 2049-2014 動(dòng)物源性飼料中鴨源性成分測(cè)定PCR方法　　

Determinationofduckderive2014-02-28發(fā)布2014-04-30實(shí)施I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：吉林省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院、國(guó)家農(nóng)業(yè)深加工產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心、中華人民共和國(guó)吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：史艷宇、劉金華、邴煒、王瑩、周亮、呂航、郎樂(lè)、張慶波、宮國(guó)強(qiáng)。1件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)3術(shù)語(yǔ)和定義4原理對(duì)樣品進(jìn)行DNA提取，通過(guò)PCR擴(kuò)增，檢測(cè)鴨特5.1鴨源性成分檢測(cè)用引物(對(duì))序列為：5.3dNTP:dATP(deoxyadenosinetriphos脫氧鳥(niǎo)苷三磷酸)、dCTP(deoxycytidinetriphosphate,脫氧胞苷三磷酸)、dTTP(deoxythymidinetriphosphate,脫氧胸苷三磷酸)。5.4動(dòng)物基因組DNA提取純化試劑盒。5.5RNaseA酶：凍干品，不含DNase。5.6蛋白酶K:凍干品。5.7三羥甲基氨基甲烷(Tris)。25.9三水合乙酸鈉、氯化鈉。5.10十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrithylammoniumbromide,CTAB)。5.11乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA-Na?·2H?O)。5.1275%乙醇、異丙醇、三氯甲烷、異戊醇、正己烷等有機(jī)試劑。5.1310×PCR緩沖液：含200mmol/LTris-HCI(pH8.4),200mmol/L氯化鉀(KC1),15mmol/L氯化鎂(MgCl?)。5.14分子量標(biāo)記：100bp~3000bpDNAMarker。5.15酶切緩沖液：含10mmol/LTris-HCI(pH7.5),10mmol/LMgCl?,50mmol/LNaCl,0.1mg/mL5.16RNaseA酶溶液：用高壓滅菌的去離子水溶解RNaseA酶為10mg/mL的溶液，分裝后于-20℃保存，避免反復(fù)凍融。5.17蛋白酶K溶液：用高壓滅菌的去離子水溶解蛋白酶K為20mg/mL的溶液，分裝后于-20℃保存，避免反復(fù)凍融。5.18乙酸鈉溶液，3mol/L:在80mL水中，加入40.81g三水合乙酸鈉，溶解后用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值到5.2,用水定容到100mL,分裝后高壓滅菌。5.19Tris-HCI,1mol/L,pH8.0:在800mL去離子水中溶解121.1gTris,冷卻至室溫后用濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0,加水定容至1L,分裝后高壓滅菌。5.20EDTA,0.5mol/L,pH8.0:稱取186.1gEDTA-Na?·2H?O,加入700mL水中，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用10mol/L氫氧化鈉調(diào)pH值至8.0,用水定容到1L,分裝后高壓滅菌。5.21CTAB提取緩沖液I:在800mL去離子水中加入46.75g氯化鈉，溶解后加入1mol/LTris-HC(pH8.0)50mL,0.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL,在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用10mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0,用水定容至1L,分裝后高壓滅菌。5.22CTAB提取緩沖液Ⅱ:在800mL去離子水中加入46.75g氯化鈉，20gCTAB,完全溶解后加入1mol/LTris-HCl(pH8.0)50mL,0.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL,用水定容至1L,分裝后高壓滅5.23Tris飽和苯酚和三氯甲烷混合液，V(Tris飽和苯酚)+V(三氯甲烷)=1+1。5.24三氯甲烷和異戊醇混合液，V(三氯甲烷)+V(異戊醇)=24+1。5.25TE緩沖液(pH8.0):在800mL水中，依次加入10mL的1mol/LTris-HCI(pH8.0)和2mL5.26電泳緩沖液：Tris54g,硼酸27.5g,0.5mol/LEDTA溶液(pH8.0)20mL,加蒸餾水至1000mL;使用時(shí)10倍稀釋。5.27溴化乙錠貯存液：用水配制成10mg/mL。5.28加樣緩沖液：稱取溴酚藍(lán)250mg,加水10mL,在室溫下過(guò)夜溶解；再稱取二甲腈藍(lán)250mg,用10mL水溶解；稱取蔗糖50g,用30mL水溶解，合并三種溶液，用水定容至100mL,在4℃保存。6儀器和設(shè)備6.2生物安全柜。6.3離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥12000r/min。6.4核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)。6.5電泳儀。36.8高壓滅菌器。μL于65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液IⅡ,混勻，65℃保溫30min~90min,期間不時(shí)輕緩顛倒混勻；加入冷卻至室溫后加入5μLRNaseA溶液(10mg/mL),室溫下放置30min;室溫12000r/min離心10和三氯甲烷+異戊醇(24+1)抽提三次，12000r/min離心10min;將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的2mL離心管液(預(yù)先加熱至65℃有利于溶解DNA)中，-20℃保存?zhèn)溆?。己烷，于磁力攪拌器上不斷振蕩混?h后，加入25mLCTAB提取緩沖液IⅡ,繼續(xù)于磁力攪拌器上振蕩Tris飽和苯酚+三氯甲烷(1+1),輕緩顛倒混勻溶液；12000r/min離心10min,取上清液，加入與上清液等體積三氯甲烷+異戊醇(24+1),輕緩顛倒混勻，12000r/min離心2min至分層；將上清液轉(zhuǎn)移至于100μLTE緩沖液(預(yù)先加熱至65℃有利于溶解DNA)中，-20℃保存?zhèn)溆谩?7.4PCR檢測(cè)7.4.1PCR反應(yīng)體系10×PCR緩沖液dNTP溶液(10mmol/L)TaqDNA聚合酶(5U/μL)上游引物(10μmol/L)下游引物(10μmol/L)DNA模板(10ng/μL-50ng/μL)4℃保存。檢測(cè)過(guò)程中設(shè)置PCR擴(kuò)增空白對(duì)照、陰性對(duì)照和陽(yáng)5如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)或進(jìn)行測(cè)序(序列參考附錄A)。酶切反應(yīng)體系(20μL):StuI酶2U,酶切緩沖液2L,加入PCR擴(kuò)增產(chǎn)物至總體積20μL。酶切在37℃下進(jìn)行，20min。酶切完成后電泳，方法見(jiàn)7.4.3。8結(jié)果判斷與表述8.1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為201bp(序列參考附錄A)。8.2限制性內(nèi)切酶酶切結(jié)果陽(yáng)性樣品PCR產(chǎn)物采用內(nèi)切酶StuI酶切后，酶切片段大小為118bp和83bp。8.3結(jié)果表述PCR產(chǎn)物為陽(yáng)性，限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物片段大小正確，確認(rèn)含有鴨源性成分，表述為檢出鴨源性成分；酶切產(chǎn)物片段大小不正確，確認(rèn)不含有鴨源性成分，表述為未檢出鴨源性成分。PCR產(chǎn)物為陰性者判定不含有鴨源性成分，表述為未檢出鴨源性成分。9檢測(cè)過(guò)程中防止交叉污染的措施按照GB