科研項目的策劃與實施-醫(yī)學科學研究入門-課件

醫(yī)學科學研究入門李卓婭(3)科研項目的策劃與實施

科研項目的策劃與實施

研究計劃的安排科研準備工作和實驗室安全實驗的實施機遇靈感組織策劃個人科研計劃安排博士生個人計劃學期安排第一學期：上課；查閱課題相關文獻；做課題相關綜述；完成開題報告（科研設計和計劃）；具體的方法學、數據等書面準備工作。第二至四學期：試劑、器材準備工作；方法學的摸索；預試和正式實驗、中期科研報告；第五學期：繼續(xù)實驗；撰寫并發(fā)表SCI文章第六學期：補充實驗；撰寫學位論文并答辯；第二至三學期、四至五學期各完成一篇論文。科研項目的策劃與實施

研究計劃的安排科研準備工作和實驗室安全實驗的實施機遇靈感科研實施原則充分的準備工作，包括實驗設計、實驗材料、實驗方法及觀察指標等；制定操作規(guī)程，包括實驗方案、操作程序、質量控制、儀器設備、標準化及標準操作規(guī)程等；規(guī)范原始記錄，包括數據記錄的準確性、完整性及更改數據的規(guī)范性，尤其是數據記錄的原始性，牢記書面記錄乃行為發(fā)生的憑證；審核監(jiān)督，包括課題負責人對課題的監(jiān)督管理、定期檢查和結果分析等。充分的準備

-書面準備工作

充分的準備

-實驗準備實驗材料與器材的準備；基本操作的訓練：試劑的配制和儲存、試劑的標記和分類樣品的處理、標記、分裝和儲存

pH值的測定與調節(jié)、蛋白定量、核酸定量加樣器的正確使用實驗室常規(guī)儀器的正確使用；基本方法學的訓練：細胞培養(yǎng)（凍存和復蘇）、分子生物學、Westernblot、FACS、免疫熒光與組化、ELISA實驗室的安全水電煤氣的安全性用電設備的安全操作玻璃儀器的安全使用氧氣瓶的安全使用高壓鍋的安全使用高溫烤箱的安全使用化學試劑的安全使用放射性同位素的安全防護

同位素的射線類型：X射線和

射線可危害人體全身多個器官；

射線因其穿透性小，僅危害皮膚淺表和眼晶體；

射線一般不引起外照射危害使用放射性物質的注意事項：①放射性同位素的實驗操作須在同位素乙級實驗室中進行；②放射性物質的存放方式要符合射線類型特點；③放射性物質的標記須清晰，包括名稱、含量及時間；④放射性廢物須按規(guī)定進行存放和處理；⑤放射性實驗的操作須進行相應屏蔽防護并在專門實驗室中進行；⑥放射性核素使用過程中對周圍環(huán)境造成的污染須及時被處理；⑦同位素實驗室應配置放射性核素監(jiān)測儀。生物的安全防護

P1：普通實驗一般在I級實驗室中操作；P2：枯草桿菌、大腸桿菌、腺病毒等須在P2級實驗室操作，并有防蚊要求；P3：烈性傳染病相關病原研究須在P3實驗室中操作；P4：烈性傳染病的大動物模型實驗須在P4級實驗室中操作。

P3和P4級實驗室均須經國家級管理部門認證。科研項目的策劃與實施

研究計劃的安排科研準備工作和實驗室安全實驗的實施機遇靈感實驗的實施預實驗：方法的熟悉；實驗條件的摸索正式試驗：實驗條件和操作標準化，設計必要的對照，保證重復性，滿足統(tǒng)計學的樣本數。實驗記錄的正確書寫和實驗數據記錄的保存實驗結果的正確觀察、分析和判斷。預實驗的目的

在正式實驗前所進行的小規(guī)模實驗。

檢查各項準備工作是否完善；確定實驗操作方法是否正確可行；獲得某些基礎數據，確定合適的樣本數和必要的統(tǒng)計學數據，以確保后續(xù)正式實驗的順利進行；摸索最佳實驗條件；初步檢驗假說。

某課題在觀察基因修飾的骨髓干細胞對Fischer344大鼠骨髓重建影響的研究中，研究者僅參照文獻報道中其他品系大鼠及小鼠骨髓抑制模型在建模時使用的鈷60照射劑量，確定了照射方案，未經預實驗而直接開始正式實驗。結果在隨后“正式”實驗中，因所選照射劑量不適合該品系鼠，多數模型鼠在極短時間內死亡，故無法觀察處理因素產生的效應結果。預實驗

以傳染或毒性因子為例，在觀測實驗中,采用稀釋度間隔很大(如100倍),用于每一稀釋度的動物很少（如兩頭）的策略。取得結果后，在可能有作用的滴定終點兩側再選擇間隔小(如5倍)的稀釋度,同時使用較大數量的動物(如5只)。通過此方法，可用最少量動物而獲得準確的結果。實驗的實施預實驗：方法的熟悉；實驗條件的摸索正式試驗：實驗條件和操作標準化，設計必要的對照，保證重復性，滿足統(tǒng)計學的樣本數。實驗記錄的正確書寫和實驗數據記錄的保存實驗結果的正確觀察、分析和判斷。正式實驗決定性試驗：判斷假說的成立與否根據預試驗結果，選定實驗條件，整個實驗過程嚴格控制試驗條件，一般不能隨便改變，已避免試驗結果的不可比。實驗方法的標準化（步驟、試劑配制、濃度稀釋等）設計各種必要的對照做好標簽工作（老鼠、組織、切片、試管）必須滿足統(tǒng)計學分析的足夠樣本數NatImmunol.2004Nov;5(11):1124-33.正式實驗決定性試驗：判斷假說的成立與否根據預試驗結果，選定實驗條件，整個實驗過程嚴格控制試驗條件，一般不能隨便改變，已避免試驗結果的不可比。實驗方法的標準化（步驟、試劑配制、濃度稀釋、儀器型號和參數等）設計各種必要的對照做好標簽工作（老鼠、組織、切片、試管）必須滿足統(tǒng)計學分析的足夠樣本數實驗誤差控制實驗方法質量的關鍵是規(guī)范意識！實驗操作規(guī)程的規(guī)范化

實驗方法標準化的策略應首先明確(尤其對某些新的觀察指標)規(guī)定標準化方法的流程，然后制定標準實驗操作規(guī)程，對各個環(huán)節(jié)進行細化處理，保證實驗人員可以不用詢問即可遵照執(zhí)行。

實驗名稱，對于具體課題的實驗操作，名稱應是特異性和具體的，勿僅標示通用性實驗名稱；實驗目的；實驗方法；實驗流程，指在實驗目的指導下的特定流程，每個具體步驟均應詳細注明實驗中實際應用的試劑名稱或劑量等，避免通用性的實驗流程；實驗材料及儀器設備等。標準物的選擇：為建立標準實驗體系，選擇標準品，并在預實驗中利用標準品確定各種實驗條件（包括最佳劑量、最佳時間和判斷標準等）。然后，以此數據作為測試樣品的標準定量或定性參數。（蛋白定量、信號分子磷酸化）操作程序的控制：建立標準操作流程，實驗操作人員僅進行機械性操作，無需任何想象、設計和預測，故要求在操作之間制定嚴密的操作流程和設計方案。（隨機性是造成實驗誤差的最常見原因，如電話及其它無關事情的干擾；協調標準化和靈活性）試劑儀器的選擇：實驗過程中應采用同一廠商相同批號或相同規(guī)格的試劑，以基本保證不同批次實驗的差異并非由試劑所致。儀器規(guī)格、型號也可能影響實驗。實驗操作規(guī)程的規(guī)范化正式實驗決定性試驗：判斷假說的成立與否根據預試驗結果，選定實驗條件，整個實驗過程嚴格控制試驗條件，一般不能隨便改變，已避免試驗結果的不可比。實驗方法的標準化（步驟、試劑配制、濃度稀釋等）設計各種必要的對照做好標簽工作（老鼠、組織、切片、試管）必須滿足統(tǒng)計學分析的足夠樣本數實驗的實施預實驗：方法的熟悉；實驗條件的摸索正式試驗：實驗條件和操作標準化，設計必要的對照，保證重復性，滿足統(tǒng)計學的樣本數。實驗記錄的正確書寫和實驗數據記錄的保存實驗結果的正確觀察、分析和判斷。實驗記錄的意義利于總結工作并尋找實驗中的差錯。實驗記錄均須歸檔保存。若一旦出現問題需要審核，完整的實驗記錄將會提供最可靠的資料。完全依靠個人記憶絕非明智之舉。將結果立即記錄于實驗記錄本，而非日后耗費時間再重新回憶記錄，以免遺忘某些重要的細節(jié)。了解早期所開展而當時并未受到重視的實驗，可從以前的實驗記錄中獲取信息和經驗。實驗記錄是成功操作實驗的關鍵。它應該是所做實驗的完整記錄。一本好的實驗記錄使人在很久以后還能重構當初實驗的內容、過程、結果和教訓。應養(yǎng)成詳細進行實驗記錄的習慣。實驗記錄務求詳盡、忠實，不僅本人一目了然，同行也能看得懂。實驗記錄的用途為：便于本人探究實驗成敗原因；供他人查找相關實驗的重要信息；為撰寫論文提供原始實驗數據。實驗記錄的內容

日期：包括年、月、日和時間，環(huán)境條件（如溫度、濕度等）；實驗名稱實驗目的實驗材料：試劑（名稱、批號、廠家、濃度、溶劑、保存條件）；儀器（名稱、型號、供貨廠商）；細胞／細菌（名稱、復蘇、凍存、保存處）；動物（品系、來源、年齡、性別、數量）；臨床標本（姓名、性別、年齡、診斷及其他臨床資料）；試劑的配制實驗方法：詳細描述實驗步驟實驗結果：包括所收集的原始數據、可視圖及實驗結果的整理。出現的問題：應分析其可能的原因及解決方法，并詳細記錄于實驗記錄本上。實驗小結：簡短的實驗結果總結和解釋，將有助于指導后續(xù)的研究。其內容包括主要結論、存在問題、改進方法和實驗體會等實驗記錄的書寫要求

-基本要求

實驗記錄的書寫要求

-基本要求

實驗記錄的書寫要求

-實驗數據的記錄

實驗數據的記錄須及時、準確、真實、完整，盡可能將原始數據記錄到實驗記錄本上，嚴禁偽造或編造數據，并避免漏記和隨意涂改。

圖表：由自動記錄儀打印的圖表和數據資料應按順序粘貼于記錄本相應位置，若圖表較多，可先將圖表按順序裝訂在一起，然后粘貼于記錄本上。壓邊簽字。熱敏紙打印的數據，打印后立即復印，并將原件和復印件一并粘貼在實驗記錄的相應位置并壓邊簽字。照片：各種照片直接粘貼于實驗記錄本相應位置，壓邊簽字。細胞或病理組織照片須標記顯微鏡倍數、染色方式等信息。腫瘤照片須含標尺刻度。此外，照片背后應寫明實驗日期和處理因素等。相應組織切片存放位置、編號和名稱等須記錄于實驗記錄本相應位置，以便后續(xù)查找并重新分析。自成體系的表格記錄：可單獨裝訂成冊，但須在實驗記錄本相應位置記錄相關信息和存放位置及編號。電子板原始數據的記錄：要有幾處拷貝；可整理分析后打印粘貼，但實驗記錄本上須明確記錄原始數據和圖表的存放位置、標號含義等基本信息。掃描圖片：各種掃描圖片應粘貼于實驗設計下方，其測定數據置于掃描圖片下方，從而有助于參考圖片分析數據。各種操作流程的記錄：各種操作流程均需記載于記錄本上，簡單的流程可直接記載，復雜的流程可打印后粘貼到記錄本。摸索實驗方法的記錄：第一次引用某方法時應注明其出處。若首次使用某種成分或方法，應進行詳細描述。凡摸索實驗方法的記錄均應盡可能完全，宜詳細記錄每一實驗條件的確定過程，以便最后確定標準實驗操作流程。須特別注意試劑的具體用量和濃度。一旦建立標準的實驗流程，即可形成完整的protocol，日后進行同一實驗流程時，除首次記錄完整的protocol外，其余僅記載實驗中改動的步驟，并表明所參照protocol的具體名稱和出處即可。實驗記錄的書寫要求

-實驗流程的記錄實驗記錄注意的問題實驗記錄不允許隔天寫（未記錄改變條件之例）以及寫在紙片上。保持實驗記錄的真實性和完整性；記錄時間（年、月、日）。原始數據（包括照片）必須貼在當天的試驗結果欄里；不要保留在公共計算機里。即便是陰性結果，也必須保留。不能僅記錄符合主觀想象的內容和自認為成功的實驗。定期整理、分析數據，并向導師匯報。養(yǎng)成實驗后及時整理和分析實驗數據的習慣，常會有意想不到的收獲。實驗資料的保存實驗的實施預實驗：方法的熟悉；實驗條件的摸索正式試驗：實驗條件和操作標準化，設計必要的對照，保證重復性，滿足統(tǒng)計學的樣本數。實驗記錄的正確書寫和實驗數據記錄的保存實驗結果的正確觀察、分析和判斷。觀察中常見的問題“留意意外之事”是研究工作者的座右銘。在觀察的鄰域中，機遇只偏愛那種有準備的頭腦。觀察中常見的問題：

-受主觀因素的影響：人工測量

-忽視細節(jié)：曼切斯特醫(yī)生教學

-視而不見；“我們見到的只是我們知道的。”－歌德司空見慣、不了解或無興趣的現象；某些既非意料之中、又非特地尋找的現象

-虛假的觀察：產生錯覺；頭腦本身滋生的（Goetingen心理學會）：頭腦容易無意識地根據過去的經歷、知識和自覺的意愿去填補空白。要學會觀察不知道的和意料外的現象；有效的觀察是指注意到某個事物，并通過將它和某個注意到的或已知的事物聯系起來，賦予其意義；因此，觀察既包含知覺因素又包含思維因素在內。實驗觀察類型自發(fā)觀察或被動觀察（即意想不到的觀察）：為進行有效的自發(fā)觀察，首先須注意某個事物或現象，將其與過去經驗中的有關知識相聯系，或在思考此現象中提出某種假說。（蘋果掉地）誘發(fā)觀察或主動觀察（即有意識安排的觀察）：通常是根據假說安排的觀察。研究過程中，研究者常注重主動觀察的現象，而忽視被動觀察的現象。最好的辦法是在觀察實驗過程中忘記自己的假說和預期結果。實驗觀察的原則客觀性與真實性：客觀地觀察實驗結果，避免對實驗觀察的傾向性和忽視意料之外的實驗現象。（假說傾向性）實時性：實驗結果的觀察和收集與時間的選擇有關，某些實驗現象瞬間出現或持續(xù)時間很短，若錯過最佳時間即難以被觀察到。（信號分子磷酸化等）完整性：實驗結果是否完整，可直接影響實驗結論。（雙峰曲線）科學觀察培養(yǎng)科學觀察習慣，提高科學觀察能力

根據實驗目的和設計進行實驗操作，除觀察某些主要變化及預期目標外，也有必要觀察操作中的某些細微變化（Western)以及儀器設備的狀況等。認真、細致、有始有終的觀察習慣：在實驗觀察中，既須目的明確地觀察實驗結果，又須對可能發(fā)生的情況有充分估計和準備。有效的科學觀察還須有良好的知識基礎，只有熟悉正常情況，才能注意到不尋常或未加釋明的現象。觀察與思維緊密結合：觀察是一種理性知識參與下的認知過程。實驗結果的分析和判斷結果的判斷：－實事求是，必須排除任何操作因素引起的誤差；－判斷實驗結果的正確性和可信性，具有統(tǒng)計學意義；－對所得到的結果進行分析，要搞清該結果可能說明的一切問題，捕獲實驗結果中的全部信息；－分析結果與結果之間的相互關系和內在的聯系；QuantitationanalysisofTNF-αinducedapoptosisandnecrosisbyFCM實驗結果的分析和判斷結果的判斷：－實事求是，必須排除任何操作因素引起的誤差；－判斷實驗結果的正確性和可信性，具有統(tǒng)計學意義；－對所得到的結果進行分析，要搞清該結果可能說明的一切問題，捕獲實驗結果中的全部信息；－分析結果與結果之間的相互關系和內在的聯系；兩型TNF體外殺瘤率兩型TNF體內抑瘤率結果判斷中常見的邏輯錯誤

不能讀懂結果的全部信息；不能邏輯分析不同結果之間的關系；看表面現象，缺乏本質認識:TNFR1表達以先后而判斷因果：慢支治療與氣候以臆想代推理：利血平與新藥視“同時”為“相關”：腦豬囊蟲病與乙型腦炎“先入為主”、“喧賓奪主”：銀環(huán)蛇咬傷中毒致呼吸麻痹和休克；以偏概全、輕率概括：服用烏洛托品疣贅消失，引申出“烏洛托品可治療人類癌腫”的結論。

預先激活TM-TNF-

反向信號對

NK92細胞殺傷的影響讀出結果的全部信息TNFR封閉肽對佐劑性關節(jié)炎腹腔巨噬細胞IL-1bmRNA的影響封閉肽正常關節(jié)炎野生型和C-28F突變型TM-TNF-a反向信號對I-kB降解的影響

I-kB→1234561：對照；2：sTNFR1；3：轉染空載PCDNA3.0＋sTNFR1；4：轉染C-28F突變型TM-TNF-a+sTNFR1；5：轉染野生型TM-TNF-a+sTNFR1；6：轉染缺失胞漿段TM-TNF-a+sTNFR1。該結果提示什么？1對照；2COS-7；3轉染空載PCDNA3.0；4轉染C-28F突變TM-TNF-

；5轉染野生型TM-TNF-

RealtimePCRC-28FTM-TNF-

突變體喪失誘導U937細胞轉錄iNOSmRNA的效應該實驗結果肯定的條件是什么？Fig4DeathmodeswitchedfromapoptosistonecrosisbymemTNF-amutantY87F

Cleavedcaspase-3-cleavedPARP(89kDa)--actin-19kDa-17kDaWild-memTNF-

control(MCF-7)Y87FmemTNF-

s-TNF

pcDNA3.0-fulllengthPARP(116kDa)C樣品排列不一致！NF-kBactivationofRajicelldecreasedafterlipidraftsdisruptionAftertreatmentofMCD,RajicellwerelysedanditslysissupernatantwereusedtoNF-kBdetection.NF-kBweredetectedbyELISA.如何下結論？mTNFexpressionvectorweretransfectedtoHelacell,andthenusethiscellaseffectcelltokillhumanEVC-304cell.Hela+TNFwtwastransfectedwithwildtypemTNF,Hela+TNF(-47)wastransfectedwithmTNFmutatedon-47whichdeletedthepalmitoylatedsite.DeletionofpalmitoylatedsitehasnoeffectonmTNFcytotoxity該結果能否說明TNF不在脂筏里？為什么？前后結果內在聯系提示什么？mTNFexpressionincreasedafterMCDtreatment.RajiRaji+MCD必須排除何種因素？如何排除？TNFR1——TNFR2——免疫共沉淀TNFR1——TNFR2——TNFR1——TNFR2——為何兩種受體共沉淀的信號分子一樣？TNFR2抗體檢測TNFR1抗體檢測TNFR抗體交叉實驗科研項目的策劃與實施

研究計劃的安排科研準備工作和實驗室安全實驗的實施機遇靈感機遇在新發(fā)現中的作用巴斯德發(fā)現減毒病原體可以作為疫苗；細菌染色的最重要的方法是丹麥內科醫(yī)生革蘭發(fā)明的：他試圖對腎切片雙染，將細胞核染成紫色，微管染成棕色，故用了龍膽紫，接著又用了碘溶液。他發(fā)現這樣處理過的組織，能用酒精使其迅速褪色，但某種細菌仍保持藍紫色，故將之用以辨別不同的細菌。離體青蛙心臟在生理鹽水中可保持跳動半小時。一次，英國倫敦大學醫(yī)院的生理學家、內科醫(yī)生林格發(fā)現他的離體青蛙心臟連續(xù)跳動了好幾小時。他非常驚訝，后來發(fā)現是他的實驗助手在制作鹽水溶液時用的不是蒸餾水而是自來水。根據這個線索就不難斷定自來水中的哪些鹽分引起了生理活動的增加。從而發(fā)現了格林氏溶液。LouisPasteur1879使大家吃驚的是：幾乎所有這些家禽都經受住了這次接種，而先前未接種的家禽，經過了通常的潛伏期后則全部死掉了。這一點甚至連巴斯德自己或許也大吃一驚，他沒有預料到這樣的成功。機遇只垂青那些懂得怎樣追求她的人。－查理.尼科爾機遇在新發(fā)現中的作用巴斯德發(fā)現減毒病原體可以作為疫苗；細菌染色的最重要的方法是丹麥內科醫(yī)生革蘭發(fā)明的：他試圖對腎切片雙染，將細胞核染成紫色，微管染成棕色，故用了龍膽紫，接著又用了碘溶液。他發(fā)現這樣處理過的組織，能用酒精使其迅速褪色，但某種細菌仍保持藍紫色，故將之用以辨別不同的細菌。離體青蛙心臟在生理鹽水中可保持跳動半小時。一次，英國倫敦大學醫(yī)院的生理學家、內科醫(yī)生林格發(fā)現他的離體青蛙心臟連續(xù)跳動了好幾小時。他非常驚訝，后來發(fā)現是他的實驗助手在制作鹽水溶液時用的不是蒸餾水而是自來水。根據這個線索就不難斷定自來水中的哪些鹽分引起了生理活動的增加。從而發(fā)明了格林氏溶液?？蒲许椖康牟邉澟c實施

研究計劃的安排科研準備工作和實驗室安全實驗的實施機遇靈感真正可貴的因素是靈感

－愛因斯坦靈感用在這里是指對情況的一種突如其來的穎悟或理解，也就是人們在不自覺地想著某一題目時，雖不一定但卻常常躍入意識的一種使問題得到澄清的思想。我決心放下工作，放下有關工作的一切思想。第二天，我在做一件性質完全不同的事情時，好像電光一閃，突然在頭腦中出現了一個思想，這就是解決的辦法……簡單到使我奇怪怎麼先前竟然沒有想到。產生靈感最典型的條件是：對問題進行了一段時間專注的研究，伴之以對解決方法的渴求；放下工作或轉而考慮其他；然后