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T/HBIQAT/HBIQA0003.2—2024食品中常見高組胺魚源性成分檢測方法DetectionofcommonHistamine-richfishderivedingredientinfoodPart2:ScomberjaponicasReal-timePCRmethod2024-08-15發(fā)布2024-10-15實施河北省檢驗檢疫學(xué)會發(fā)布T/HBIQA0003-2024《食品中常見高組22規(guī)范性引用文件GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試GB/T27403實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分又稱白腹鯖、日本鮐、鮐鲅魚、青花魚,屬于硬骨魚綱(Osteichthyes)、鱸形目(Perciformes)、鯖亞3.2實時熒光PCRreal-3.3Ct值cyclethreshol4.1PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerasechainreaction)4.2DNA:脫氧核糖核酸(deoxyribonuleicacid)4.3ATP-6:線粒體基因atp合成酶復(fù)合物亞基64.4dNTP:脫氧核苷酸三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphat4.5CTAB:十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrithylammoniumbromide)4.6Tris:三(羥甲基)氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethan4.7EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic4.8FAM:羧基熒光素(carboxyfluorescei3RNA基因F:TTGCCCTTGGAGTTCGACTAACATP-6基因R:GCAGCTGTTGCGATTAGTTGP:FAM-CCAACCTTACAGCCGGCCACCTTC-BHQ1),),6.9熒光PCR預(yù)混液(2×)。8檢驗步驟魚罐頭、魚腸、魚丸等食品取肉糜300mg,置于三氯甲烷:甲醇:水混4上清液至另一新離心管中,加入0.8倍體積異丙醇,混勻后室溫下靜置1h。12000r/min離心10備用。也可用等效的商業(yè)化DNA提取試劑盒提取樣品DNA。取適量DNA溶液原液,使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計分別測定260nm和28c=A260×N×50··························(1)c——DNA濃度,單位為微克每微升(μg/μLN——核酸稀釋倍數(shù)。實時熒光PCR反應(yīng)參數(shù)見表2。每個樣品各做兩個平行管,可先將反應(yīng)試劑及引物預(yù)混成混合液。表2實時熒光PCR反應(yīng)體系終濃度反應(yīng)體系/μLF(10μmol/L)1R(10μmol/L)1P(10μmol/L)1DNA模板(50-100ng/μL)— ),檢驗過程中分別設(shè)陽性對照、陰性對照和空白對照。以日本鯖提取的DNA為陽性對照,以已知不含有日本鯖的樣品提取的DNA為陰性對照,以滅菌水為空白對照。樣品、陽性對照、陰性對照、空白對照各設(shè)置兩個平行。5c)陽性對照:有熒光對數(shù)增長,且熒光通道d)內(nèi)參照:被檢
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