CAR-T治療的幕后英雄：慢病毒載體培養(yǎng)及純化

CAR-T治療的幕后英雄：慢病毒載體培養(yǎng)及純化前

言慢病毒載體使得真核細胞基因修飾、表達變得更簡單，在實驗室研究、工業(yè)生產(chǎn)和臨床治療中應用越來越廣泛。比如第三代自滅活慢病毒載體用于造血干細胞的基因修飾，治療原發(fā)性免疫缺陷和血紅蛋白病。慢病毒載體作為CAR轉(zhuǎn)導T細胞的載體，是CAR-T細胞生產(chǎn)過程中的關鍵原料，對實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)、縮短生產(chǎn)周期具有重要意義。01慢病毒載體和CAR-T慢病毒載體是一種源于人類免疫缺陷病毒（HIV）的基因載體。在構建慢病毒載體時，為了避免產(chǎn)生有復制能力的病毒，會把HIV-1基因組分裝與不同的質(zhì)粒中，再共轉(zhuǎn)染細胞，獲得只有一次感染能力而無復制能力的慢病毒載體。目前慢病毒載體已從兩質(zhì)粒系統(tǒng)發(fā)展到四質(zhì)粒系統(tǒng)，安全性不斷提高。目前常用的是四質(zhì)粒系統(tǒng)，有更廣泛的應用，比如基因編輯、基因治療、轉(zhuǎn)基因動物、藥物研究、CAR-T細胞治療等。慢病毒載體有更廣泛的宿主，能夠感染分裂和非分裂細胞。對于難轉(zhuǎn)染的細胞，如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等，能極大的提高目的基因的轉(zhuǎn)導效率。慢病毒可以將外源基因有效的整合到細胞染色體中，在靶細胞中獲得持續(xù)高效穩(wěn)定的表達。慢病毒載體還可以攜帶5kb以上的目的基因，將cDNA克隆到慢病毒載體中。慢病毒載體的生產(chǎn)和用途示意圖（源自參考文獻）CAR-T細胞治療在多種癌癥的臨床上取得成功，是目前醫(yī)學研究前沿熱門的方向之一。CAR-T生產(chǎn)制備流程主要包括T細胞富集、分化、擴增，通過病毒或非病毒載體進行CAR基因轉(zhuǎn)移，然后再進行體外CAR-T細胞擴增，最終制成細胞產(chǎn)品。因此將特定的CAR基因轉(zhuǎn)導進入T細胞的病毒載體是整個生產(chǎn)過程的關鍵原料。目前大部分CAR-T細胞的制備使用慢病毒載體，如諾華的Kymriah和Juno的Breyanzi，依靠慢病毒載體完成CAR-T細胞制造。CAR-T細胞治療示意圖（源自參考文獻）02慢病毒載體生產(chǎn)制備慢病毒載體作為CAR-T的核心環(huán)節(jié)，其質(zhì)量對細胞產(chǎn)品及其治療效果具有直接影響。雖然生產(chǎn)慢病毒載體的步驟并不復雜，但如何大規(guī)模生產(chǎn)符合cGMP要求的高質(zhì)量慢病毒載體仍具有挑戰(zhàn)性。慢病毒的生產(chǎn)是一個持續(xù)幾天的細胞培養(yǎng)過程，將病毒載體轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中。主要有貼壁和懸浮兩種培養(yǎng)方式。小規(guī)模研究可以選擇貼壁培養(yǎng)，但大規(guī)模生產(chǎn)需要懸浮培養(yǎng)。慢病毒的大規(guī)模生產(chǎn)常用HEK293T細胞系，可以在沒有貼壁的情況下迅速懸浮生長。將包裝細胞在培養(yǎng)基中傳代數(shù)次，達到一定數(shù)量后，用病毒包裝質(zhì)粒和目的基因載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞。在幾天的培養(yǎng)過程中，包裝細胞會產(chǎn)生大量慢病毒顆粒，可以從培養(yǎng)基中收獲。病毒載體純化可使用多種方法，例如梯度純化法或色譜法。除了細胞系，慢病毒的懸浮無血清培養(yǎng)已逐步替代傳統(tǒng)的貼壁培養(yǎng)模式。懸浮培養(yǎng)能夠降低成本和污染風險，培養(yǎng)及純化步驟更簡單，更容易放大。在成本方面，培養(yǎng)基是不可忽略的因素，選擇來源和化學成分明確、不含血清的培養(yǎng)基，會極大的降低成本和簡化下游純化工藝，并降低污染風險。義翹神州已成功開發(fā)多款適用于HEK293細胞懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，屬于無血清、無抗生素、無動物源性組分的即用型培養(yǎng)基，可用于慢病毒載體大規(guī)模懸浮培養(yǎng)。大規(guī)模生產(chǎn)還需要考慮雜質(zhì)去除，比如宿主DNA，在200L的反應器中需要750mg的質(zhì)粒DNA，意味著轉(zhuǎn)染過程中會有大量的殘留，因此需要選擇合適的核酸酶進行去除?？偟膩碚f，理化性質(zhì)不穩(wěn)定，回收率低，培養(yǎng)體系和純化工藝等未攻克的問題，依舊是慢病毒規(guī)模化生產(chǎn)的瓶頸和關鍵。義翹神州慢病毒載體包裝相關產(chǎn)品義翹神州可以提供慢病毒包裝的關鍵原材料如Sinofection?轉(zhuǎn)染試劑、無血清HEK293培養(yǎng)基和質(zhì)粒生產(chǎn)，以及慢病毒純化工藝過程中用于去除宿主核酸的GMP級核酸酶等。另外，我們也可提供全面的HEK293細胞庫檢定服務，充分保障CAR-T藥物的安全性。無血清細胞培養(yǎng)基及補料液新品推薦，歡迎咨詢SMM293-CD1培養(yǎng)基（貨號：M293CD1）相同條件下，使用SMM293-CD1培養(yǎng)基，HEK293F細胞密度更好。其他無血清、無動物源的HEK293培養(yǎng)基貨號名稱應用M293TIISMM293-TII培養(yǎng)基新一代產(chǎn)品，HEK293細胞懸浮培養(yǎng)、蛋白瞬時表達、慢病毒包裝M293TISMM293-TI培養(yǎng)基原代產(chǎn)品，HEK293細胞懸浮培養(yǎng)、蛋白瞬時表達、慢病毒包裝細胞轉(zhuǎn)染試劑義翹神州擁有高品質(zhì)的轉(zhuǎn)染試劑Sinofection?TransfectionReagent（Cat#:STF02），細胞毒性小、重復性高，可用于慢病毒載體的高效轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率基本可以達到95%以上。GMP級核酸酶義翹神州提供GMP級條件下生產(chǎn)的全能核酸酶SuperNuclease（Cat#:GMP-SSNP01），無動物源性，可高效降解單鏈、雙鏈、線性、環(huán)狀、超螺旋等任何形式的DNA及RNA。超高活性，應用場景廣泛且使用量低不易殘留，質(zhì)量、性能、供貨能力可靠，并已完成在FDA的藥物主文件申報備案（DMF號：35978），滿足藥物申報的需求。相同條件下，不同用量的GMP級全能核酸酶和其他品牌核酸酶對鮭魚精DNA的降解效率相當細胞庫檢測義翹神州遵循NMPA、FDA、EMA、ICH等多個國內(nèi)外法規(guī)和指導原則，建立了全面的細胞庫測定方法，助力于CAR-T細胞治療的安全性，主要包括以下幾個檢測方面：無菌檢查、支原體檢查、內(nèi)外源病毒污染檢查、成瘤性檢查等。慢病毒包裝質(zhì)粒生產(chǎn)義翹神州升級改造后的慢病毒質(zhì)粒制備平臺，采用GMP級別的生產(chǎn)線，對過程和最終產(chǎn)品的嚴格管控，確保了最終產(chǎn)品質(zhì)量符合客戶需求。義翹神州可以提供從μg級別、mg級別至g級別不同規(guī)模的科研級質(zhì)粒生產(chǎn)服務，滿足不同的需求。參考文獻：1.XiaoyuWang,etal.Recentadvancesinlentiviralvectorsforgenetherapy.2.NataliaElizaldeandJuanCarlosRamírez.Lentiviralvectors:keychallengesandnewdevelopments.3.MichaelC.MiloneandUnaO’Doherty.Clinicaluseoflentiviralvectors.4.DavidEscors,KarineBreckpot.Lentiviralvectorsingenetherapy:theircurrentstatusandfuture