5.流式細胞術(shù)的樣品制備課件

5.流式細胞術(shù)的樣品制備流式細胞術(shù)的樣品制備

5.流式細胞術(shù)的樣品制備FCM的樣品制備包括單分散細胞懸液制備技術(shù)，細胞生物學特征標記技術(shù)及熒光染色技術(shù)，F(xiàn)CM是對細胞或細胞器的結(jié)構(gòu)和某些功能進行定量測定，并可以根據(jù)細胞亞群的特點性質(zhì)對其進行分類的技術(shù)。

FCM臨床應用范圍包括診斷，提示預后，生物學特征的表現(xiàn)和對治療的不同方法敏感性的評價。

FCM的實驗對象是單細胞或單細胞核的懸液，在FCM技術(shù)中制備出合格的單細胞懸液是非常重要的一環(huán)，這些單細胞懸液主要來源于單層細胞、血液、脫落細胞、實體組織及石蠟包埋組織等。5.流式細胞術(shù)的樣品制備

一、實體組織單分散細胞的制備

㈠新鮮實體組織新鮮實體組織是手術(shù)或活檢后根據(jù)檢測目的而采取的樣品，此樣品應及時進行適當?shù)谋４嫣幚?，如及時用固劑或低溫對組織進行保存，以避免由于室溫過高、放置時間過長而造成組織自溶，影響檢測結(jié)果。5.流式細胞術(shù)的樣品制備新鮮實體組織單細胞懸液制備方法如下：

⒈酶消化法

⒉機械法

剪碎法

網(wǎng)搓法

研磨法

⒊化學試劑處理法5.流式細胞術(shù)的樣品制備⒈酶消化法酶對實體組織分散作用原理主要有三方面：

﹡一是可以破壞組織間的膠原。

﹡二是可以水解組織細胞的緊密連結(jié)裝置的蛋白性物質(zhì)。

﹡三是可以水解組織間的粘多糖物質(zhì)。酶消化法是實體組織分散為單細胞的主要方法，常用的酶類試劑有：

?蛋白酶類，(如胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，鏈蛋白酶和中性蛋白酶等)都能夠釋放所有組織中的細胞；

?胰酶，能水解脂鍵和肽鍵；

?膠原酶，能降解幾種分子類型的膠原；

?溶菌酶，能水解糖蛋白和肽的糖苷鍵；

?彈性蛋白酶，能消化連接組織的糖蛋白和彈性蛋白的纖維，可用于解離血管、心臟和肝臟的細胞。5.流式細胞術(shù)的樣品制備

為使組織細胞分散下來，應用酶學方法必須注意條件的選擇和影響因素：

※

酶需要溶解于適當?shù)娜芤褐校@種溶液不致于造成酶效價降低

※

注意組織在消化液中的消化時間

※注意酶活性的PH值

※

注意酶的適用濃度

※

隨時注意影響酶活性的其他因素各種酶的分散程度都有一定的限制性，特別是在進行免疫標記實驗時，酶處理可能改變細胞膜的成分，從而影響細胞亞群的區(qū)分。應指出，用于組織分散的很多酶是不夠純的，不僅含有一種占主導的酶，而且在不同程度上也混有其他污染物質(zhì)，它們的活性可能有利于組織分散，也可能對組織的結(jié)構(gòu)或功能產(chǎn)生不利的影響。5.流式細胞術(shù)的樣品制備酶學方法的一般程序：①將適合于酶消化的組織置于離心管中。②將選好的酶溶液1-2ml加入盛有被消化組織的試管中。③一般消化20-30分鐘(恒溫37oC或室溫)，消化期間要間接振蕩或吹打。④終止消化，收集細胞懸液，以尼龍網(wǎng)(200目)過濾，除去大團塊，以低速離心除去細胞碎片。⑤將制備好的單細胞進行流式細胞術(shù)分析或保存。5.流式細胞術(shù)的樣品制備

⒉機械法機械法分裂實體組織包括：用剪刀剪碎或用鋒利的解剖刀剁碎，用勻漿器勻漿，用細注射針頭抽吸細胞或細胞器懸液以分散細胞，采用網(wǎng)搓法同樣也能獲得大量的細胞，機械法易造成細胞懸液中細胞碎片和細胞叢結(jié)量的不穩(wěn)定，所以機械法常與其他方法配合使用。5.流式細胞術(shù)的樣品制備常用的幾種機械法制備過程如下：

剪碎法：①將組織塊放入平皿中，加入少量的鹽水。②用剪刀將組織剪至勻漿狀。③加入10ml生理鹽水。④用吸管吸取組織勻漿，先以100目尼龍網(wǎng)過濾到試管中。⑤離心沉淀1000prm3-5分鐘，再用鹽水洗三次，每次以短時低速離心沉淀(500-800prm)去除細胞碎片。⑥以300目尼龍網(wǎng)過濾除去細胞團塊。⑦70%冰乙醇固定，放入0-4℃冰箱。

5.流式細胞術(shù)的樣品制備

網(wǎng)搓法：①將100目，300目尼龍網(wǎng)扎在小燒杯上。②把剪碎的組織放在網(wǎng)上，以眼科鑷子輕輕搓組織塊，邊搓邊用鹽水沖洗，直到將組織搓完。③收集細胞懸液，離心沉淀1000prm，5分鐘。④70%乙醇固定，置0-4℃冰箱備用。5.流式細胞術(shù)的樣品制備

研磨法準備一只70ml組織研磨器①將組織剪碎至小塊。②放入組織研磨器中，加入1-2ml生理鹽水。③轉(zhuǎn)動研棒，研至勻漿即可。④加入生理鹽水10-20ml，沖洗研器。⑤收集細胞懸液，并經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過濾，離心沉淀500-800prm，1-2分鐘，再用生理鹽水洗三次，離心沉淀。5.流式細胞術(shù)的樣品制備

⒊化學試劑處理法

化學試劑處理法的主要原理是將細胞間起粘連作用的鈣鎂離子置換出來，從而使細胞分散下來。試劑配制：①0.2%EDTA配制

EDTA0.2g溶解后，加入Hank′s液100ml，封裝高壓消毒，置0-4℃保存。②胰酶加EDTA配制胰酶0.25g+PBS(PH7.0)200ml，濃度0.125%，EDTA0.2g+PBS(PH7.0)200ml，濃度0.2%。各取40ml混合，分裝置冰箱保存，用時過濾既可。5.流式細胞術(shù)的樣品制備實驗步驟：①將組織切成薄片放入試管。②加入EDTA液5ml，室溫，半小時，棄之。③加入胰酶+EDTA液5-10ml，再37℃恒溫水浴30分鐘，間斷振蕩3-5次。④用300目尼龍網(wǎng)過濾，離心沉淀1000prm，5分鐘，再以生理鹽水洗2-3次，離心500-800prm，1-2分鐘。⑤70%乙醇固定置冰箱中被檢。5.流式細胞術(shù)的樣品制備

實驗證實，用化學試劑處理組織導致細胞成活率降低，細胞產(chǎn)額較低，細胞碎片和細胞叢結(jié)的量不穩(wěn)定，化學試劑可單獨使用，也可與其他方法聯(lián)合使用。機械法常常造成嚴重的細胞損傷，較低的細胞產(chǎn)量，為使細胞碎片不影響FCM檢測結(jié)果，需采用適當?shù)姆椒ǔニ槠虮M量減少碎片。酶學法、化學法對實體腫瘤的分散解聚是較理想的，但是會造成所測化學成分的不良影響，所以根據(jù)使用目的去選擇合適的單細胞懸液制備方法，才能獲得理想的樣品和更好的FCM結(jié)果。5.流式細胞術(shù)的樣品制備注意事項：Ⅰ新鮮組織標本應及時進行保存，以免組織在室溫下放置時間過長，造成細胞自溶導致DNA降解，影響FCM測定結(jié)果。Ⅱ根據(jù)實驗目的的選用最佳的細胞固定方法，以免由于固定劑的原因，造成FCM檢測結(jié)果的不穩(wěn)定。Ⅲ酶學法要注意條件的選擇和影響因素，要注意酶的溶劑，消化時間、pH值、濃度等方面對酶消化法的影響。Ⅳ需注意不同的組織選用適當?shù)姆椒?，如富于細胞的腫瘤(淋巴瘤、視神經(jīng)母細胞瘤、腦瘤、未分化癌、髓樣癌以及一些軟組織肉瘤)不一定要用酶學或化學法，往往用單獨的機械法就可以收到大量單分散細胞。Ⅴ在使用酶學方法時，要重視酶的選用，如含有大量結(jié)締組織的腫瘤，如食管癌、乳癌、皮膚癌等，用膠原酶為好，因為膠原酶具有在Ca2＋、Mg2＋存在或在血清狀態(tài)下不發(fā)生活性降低的特征。5.流式細胞術(shù)的樣品制備實驗方法：①石蠟包埋組織在切片機上切取40-50μm厚的組織片3-5片。②將切取的組織片放入試管中。③加入二甲苯5-8ml脫蠟(在室溫下)，1-2天，視石蠟脫凈與否，可更換一次二甲苯，蠟脫凈后棄去二甲苯。④水化：依次加入100%、95%、70%、50%梯度的酒精5ml，每步10分鐘，去乙醇，加入蒸餾水3-5ml，10分鐘后棄之。⑤消化：加入2ml0.5%胃蛋白酶(pH值1.5-2.0)置37℃恒溫水浴中消化30分鐘，消化期間每隔10分鐘振蕩一次。石蠟包埋組織單細胞懸液的制備5.流式細胞術(shù)的樣品制備⑥消化30分鐘后，立即加入生理鹽水終止消化。⑦經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過濾，未消化完的組織片可以二次消化。⑧收集細胞懸液，離心沉淀1500prm，以生理鹽水漂洗1-2次，離心沉淀1500prm，再以生理鹽水漂洗1-2次，離心沉淀500-800prm，去碎片。⑨制備好的單細胞懸液作涂片，AO染色在熒光顯微鏡下觀察，應為完整細胞核，核發(fā)出黃綠色熒光。⑩單細胞樣品1×106細胞/ml，加入熒光染液溴化乙啶(EB)或碘化丙啶(PI)1ml，置0-4℃冰箱30分鐘，經(jīng)500目銅網(wǎng)過濾后上機檢測。5.流式細胞術(shù)的樣品制備注意事項：一定將石蠟從組織中脫干凈，檢驗是否將石蠟脫凈的方法是，棄去二甲苯，加入100%乙醇，如無絮狀物浮起，即視為石蠟已脫凈，反之則沒有脫凈。消化時間不可過長，以免造成已釋放出的細胞核被消化掉。切片不可過薄或過厚，過薄則碎片增多，影響流式分析結(jié)果，過厚造成脫蠟不凈或脫蠟時間過長，一般以40-50μm為宜。5.流式細胞術(shù)的樣品制備

二、血液單細胞樣品的制備血液是天然的單細胞分散細胞懸液，血中的細胞成分在生理狀態(tài)下呈分散的游離狀態(tài)，它是流式細胞分析的最合適的樣品，全血中含有紅細胞，白細胞和血小板三種有形成分，但流式細胞的檢測是以某一群細胞為測定對象，因此在檢測前須將所測的某群細胞分離出來，下面分別介紹幾種血細胞的分離制備方法。

5.流式細胞術(shù)的樣品制備㈠淋巴細胞的制備⒈取肝素抗凝血2.0ml，用生理鹽水2ml將全血稀釋至4ml。⒉先將3ml人淋巴細胞分離液放入另一個離心管，然后將稀釋后的血沿試管內(nèi)壁緩緩加入到分離液面之上，勿用力過大，以免造成血液與分離液混合，保持清晰的分層狀態(tài)。⒊離心2000prm，30分鐘，室溫18-20℃，離心后可見試管內(nèi)的血液清楚的分為4層，上層為血漿層，中層為分離液層(淋巴細胞所處的位置在血漿層與分離液層中間)，底層為紅細胞，紅細胞上為粒細胞。⒋用吸管將上層與中層之間的淋巴細胞吸出，收集到另一支離心管，用生理鹽水稀釋至10ml，離心洗滌2次，每次均以1500prm,10分鐘，棄上清后即得到純度較高的淋巴細胞，但可有少量的單核細胞。⒌70%冰乙醇固定，置4℃冰箱保存。5.流式細胞術(shù)的樣品制備㈡粒細胞的制備⒈用淋巴細胞分離液對細胞進行分層。⒉粒細胞的比重較淋巴細胞稍大，因此經(jīng)分離液分離后的粒細胞，分層于紅細胞之上，分離液的底部。⒊以吸管慢慢將粒細胞層吸出，置另一只離心管內(nèi)，以5ml的Hank′s液洗滌三次，每次離心沉淀1500prm，10分鐘。⒋在吸取粒細胞的同時常附帶一些紅細胞，因此需將紅細胞去除，加入1.0ml低滲溶液，30-40秒。⒌再以Hank′s液洗滌2次，即可獲得純度大于95%以上的粒細胞。5.流式細胞術(shù)的樣品制備㈢單核細胞制備1.取肝素1000u/ml抗凝全血3.Om1,加入3.0ml生理鹽水將血稀釋,均在無菌條件下操作。2.1640培養(yǎng)液10.0ml,放入培養(yǎng)瓶內(nèi),將稀釋血加入培養(yǎng)液中,混勻,與培養(yǎng)瓶接觸面要大。3.放入37℃恒溫箱內(nèi)孵育30-40分鐘,取出培養(yǎng)瓶,將血傾倒掉,用生理鹽水將培養(yǎng)瓶輕輕沖洗一次,以去掉殘留的血液,這時培養(yǎng)瓶壁上貼附了大量的單核細胞,因為單核細胞具有短時培養(yǎng)期內(nèi)貼附快的特,而其他細胞沒有這個特性,所以利用這一特性進行短時培養(yǎng)可獲得較純的單核細胞。5.流式細胞術(shù)的樣品制備4.將粘附于培養(yǎng)瓶壁上的單核細胞消化下來,用0.25%胰酶消化10－15分鐘,室溫下,并不斷搖震,以促使細胞脫落下,單核細胞的粘附力很強,用酶消化往往獲得細胞數(shù)少,目前亦采用機械的方法,用一橡皮刷,伸入培養(yǎng)瓶在瓶壁上輕擦,將細胞刮取下,但切勿用力過大,造成細胞損傷過多。5.脫落下來的細胞移入離心管,離心沉淀1500prm,5分鐘,再以生理鹽水漂洗2－3次,每次離心800prm,2分鐘,以去除碎片雜質(zhì)。6.將細胞涂片,以丫啶橙染色,置熒光顯微鏡下觀察形態(tài)和純度。7.將細胞以70%乙醇固定,置0-4℃冰箱保存?zhèn)錂z。5.流式細胞術(shù)的樣品制備5.流式細胞術(shù)的樣品制備㈣骨髓細胞中白血病細胞的制備1.抽取骨髓0.5ml。2.將0.5ml骨髓標本滴入肝素(1000u/ml)抗凝2.0mlPBS液中。3.再加入PBS液稀釋至4ml。4.將稀釋的4ml骨髓液緩慢加入到盛有3.0ml的人類淋巴細胞分離液面之上,保持不要混合。5.離心沉淀2000prm,20分鐘。6.在以上條件下,將淋巴細胞、單核細胞、髓性細胞,白血病細胞與較大的紅細胞,紅母細胞在PBS－人類淋巴細胞分離液中形成一個界面。7.吸去紅細胞和紅母細胞。8.以PBS液洗留下的界面上的細胞,離心1000轉(zhuǎn),3分鐘。9.棄上清液,即可進行標記染色和流式分析。5.流式細胞術(shù)的樣品制備㈤網(wǎng)織紅細胞的制備1.取全血0.5ml，注入盛有0.5ml的0.1mol/LEDTA溶液中。2.用微量取溶器吸取50ulEDTA抗凝血置于另一離心管中，加入Good′s緩沖液5.0ml，離心沉淀

100Oprm，5分鐘,連續(xù)洗三次。3.將沉淀細胞加入1.0ml拘橡酸納緩沖液，輕輕振蕩懸浮。4.將懸浮液緩注入盛有4.0ml0.1%戊二醛緩沖液中固定，若即上機檢測，固定15分鐘即可，如不馬上檢測，可固定2小時后，PBS洗去固定劑，加入1.0ml枸櫞酸納緩沖液，置入4.0℃冰箱備檢，可保存一周時間。5.FCM分析前，用PBS洗去固定劑，加入0.5ml0.01%派若寧Y工作液，染色30分鐘后，離心沉淀棄去染液，用PBS離心洗滌一次，1500prm，5分鐘，去上清液，再用PBS將細胞懸浮上機檢測。5.流式細胞術(shù)的樣品制備三、脫落細胞單細胞懸液的制備在臨床實際工作中，可收集到大量自然脫落的細胞，這些細胞標本經(jīng)過簡單的處理，就可得到較好的單分散細胞懸液，所以是流式細胞術(shù)檢測的天然樣品，下面介紹幾種常見的脫落細胞樣品制備方法。㈠宮頸脫落細胞懸液的制備1.首先用生理鹽水沖洗宮頸表面的分泌物,以海棉輕拭宮頸表面,將海棉中吸附的脫落細胞洗脫到20ml生理鹽水中。2.收集細胞懸液,以150Oprm離心沉淀,用生理鹽水洗滌2次,每次5分鐘,棄上清后加入70%乙醇3ml固定備檢。5.流式細胞術(shù)的樣品制備㈡食管脫落細胞懸液的制備1.將食管拉網(wǎng)器上的細胞洗脫到10ml生理鹽水中,以1500prm離心沉淀,再用生理鹽水洗滌2次,離心500-800prm1-2分鐘,棄上清。2.調(diào)整細胞數(shù)在1X106/ml,可進行標記