《RNA建庫流程》課件

RNA建庫流程RNA建庫是從RNA提取開始的一系列實驗流程,用于分析和研究RNA分子的結(jié)構(gòu)和功能。這個過程涉及多個關(guān)鍵步驟,如RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和文庫構(gòu)建等,需要嚴格操作以確保結(jié)果的準確性和可靠性。RNA提取概述核酸提取從各種生物樣品中提取高純度的RNA是后續(xù)實驗的基礎。實驗技術(shù)RNA提取采用離心柱吸附、化學裂解等多種成熟技術(shù)。質(zhì)量檢測對提取的RNA進行濃度、完整性等多指標測定以確保質(zhì)量。RNA質(zhì)量控制良好的RNA質(zhì)量是進行后續(xù)分析的前提。通過對提取的RNA進行質(zhì)量檢測和評估,可以確保實驗的可靠性。常用的質(zhì)量檢測方法包括紫外分光光度計法、凝膠電泳法和微流控芯片電泳法。檢測指標合格標準作用濃度≥50ng/μl提供足夠的模板用于后續(xù)分析純度(A260/A280)1.8-2.2評估RNA是否含有蛋白質(zhì)或其他雜質(zhì)污染完整性(RIN值)≥7判斷RNA分子鏈是否完整,評估RNA樣品的質(zhì)量rRNA去除方法親和層析法利用特異性結(jié)合探針捕獲并去除rRNA分子,可以高效去除樣品中的rRNA片段。酶切法采用特異性的核酸內(nèi)切酶切割rRNA分子,有效降低rRNA在總RNA中的比例。差減法通過差減雜交排除rRNA序列,可以大幅提高轉(zhuǎn)錄組測序中mRNA的檢測覆蓋率。磁珠分離法利用磁珠上連接的rRNA特異性探針捕獲并分離rRNA分子,提高了純度和效率。彈性測序建庫流程樣品準備根據(jù)不同樣品類型進行適當?shù)腞NA或DNA提取。確保獲得足夠高質(zhì)量的核酸。片段化使用酶或機械方法將核酵分解成所需長度的片段?？刂坪闷未笮》植?。末端修復采用特殊酶對片段末端進行修復和磷酸化,為后續(xù)連接接頭做準備。文庫構(gòu)建將修復后的片段與特異性接頭連接,形成初步的測序文庫。優(yōu)化連接條件。擴增與純化進行PCR擴增和磁珠法純化,獲得高質(zhì)量的文庫供后續(xù)測序?？俁NA轉(zhuǎn)錄本建庫步驟1總RNA提取使用TRIzol等試劑從樣品中提取總RNA2DNA去除使用DNaseI處理去除DNA污染3poly(A)選擇利用oligo(dT)磁珠富集poly(A)+RNA4第一鏈cDNA合成以poly(A)+RNA為模板,合成第一鏈cDNA總RNA轉(zhuǎn)錄本建庫的關(guān)鍵步驟包括總RNA提取、DNA去除、poly(A)+RNA富集,以及第一鏈cDNA合成。這些步驟確保得到高質(zhì)量的mRNA做為測序文庫的模板。后續(xù)流程還包括第二鏈cDNA合成、片段化、末端修復、接頭連接等操作。小RNA建庫步驟1總RNA提取從樣品中分離并純化總RNA2rRNA去除去除核糖體RNA,富集小RNA分子33'接頭連接使用特異性接頭連接至小RNA末端4逆轉(zhuǎn)錄及擴增將小RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA并進行PCR擴增5文庫構(gòu)建將cDNA片段連接上測序接頭以構(gòu)建文庫小RNA建庫流程關(guān)鍵在于從總RNA中有效分離富集小RNA分子,并通過接頭連接、逆轉(zhuǎn)錄等步驟構(gòu)建出可用于測序的文庫。這一過程需要特異性的試劑和仔細的操作,以保證獲得高質(zhì)量的小RNA文庫。有取向性的建庫流程1模板RNA定向利用附加引物或特殊測序接頭的設計,可實現(xiàn)RNA序列的方向性定義。確保最終測序結(jié)果能反映原始RNA分子的5'-3'極性。2cDNA合成定向通過使用引物附加序列或特殊酶切位點,在cDNA合成過程中即可記錄RNA鏈的5'-3'方向。這為后續(xù)測序分析提供了寶貴的定向信息。3文庫構(gòu)建定向?qū)⒁锔郊有蛄谢蛱厥膺B接子引入,確保最終測序文庫保留原始RNA分子的方向性。這樣可以還原轉(zhuǎn)錄本的完整結(jié)構(gòu)信息。低投入量建庫方法微量RNA投入當樣品RNA含量有限時,需要采用特殊的低投入量建庫方法,如超低投入的轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)。這可以實現(xiàn)從極少量樣品中得到高質(zhì)量的測序結(jié)果。特殊文庫制備對于低投入量的RNA樣品,需要使用優(yōu)化過的文庫制備協(xié)議,如SMART技術(shù)。這可以大幅提升從少量RNA中獲得可靠序列數(shù)據(jù)的能力。單細胞RNA測序當研究對象是極少量的單個細胞時,需要采用專門的單細胞RNA測序技術(shù)。這可以對個體細胞的轉(zhuǎn)錄組進行深入分析,揭示細胞異質(zhì)性。核酸修飾檢測建庫1DNA/RNA修飾測序檢測DNA或RNA中的甲基化、羥甲基化等表觀遺傳學修飾模式。2CHIP-seq/RNA-seq聯(lián)用通過結(jié)合特異性抗體的免疫親和層析技術(shù)與RNA測序，確定基因調(diào)控網(wǎng)絡。3轉(zhuǎn)錄后修飾分析分析mRNA、tRNA、snoRNA等非編碼RNA中的腺苷甲基化、假尿嘧啶化等。4單分子檢測利用電流信號變化檢測DNA/RNA中的5mC、5hmC等修飾堿基。核酸編輯檢測建庫原理核酸編輯技術(shù)可以精確地修改DNA或RNA序列。通過專門的建庫流程,可以檢測編輯后的核酸變化,并定量分析編輯效率。步驟采集樣品>RNA提取>RT-PCR擴增>文庫構(gòu)建>測序分析>生物信息分析應用檢測CRISPR編輯效率、評估RNA干擾水平、分析轉(zhuǎn)錄本編輯差異等,在醫(yī)學研究和基因工程中廣泛應用。單細胞RNA建庫流程1細胞分離從樣本中分離出單個細胞2lysis&RNA捕獲裂解細胞并捕獲單細胞RNA3逆轉(zhuǎn)錄將單細胞RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA4文庫構(gòu)建利用cDNA構(gòu)建單細胞RNA測序文庫5測序?qū)渭毎鸕NA測序文庫進行高通量測序單細胞RNA測序技術(shù)可以克服傳統(tǒng)RNA測序的局限性,實現(xiàn)對個體細胞轉(zhuǎn)錄組特征的精準分析。該流程首先從樣本中分離出單個細胞,然后對單個細胞進行裂解并捕獲其RNA,接著將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,最后構(gòu)建單細胞RNA測序文庫并進行高通量測序。該技術(shù)可廣泛應用于基因表達譜分析、細胞類型鑒定、疾病診斷等領域。長readssequencing建庫樣品選擇選擇合適的長reads測序技術(shù)所需的樣品類型,如植物基因組DNA、細菌/病毒基因組DNA/RNA等。樣品純化使用合適的方法對樣品進行提取和純化,確保樣品質(zhì)量滿足測序要求。文庫構(gòu)建根據(jù)所選長reads測序技術(shù),采用相應的文庫構(gòu)建方法,如SMRTbell文庫制備、SuperScriptcDNA合成等。文庫質(zhì)控對構(gòu)建的文庫進行質(zhì)量檢測,確保其符合長reads測序的要求。數(shù)據(jù)分析采用合適的生信分析流程對長reads測序數(shù)據(jù)進行分析和注釋。FFPE樣本建庫1樣本收集采集FFPE(石蠟包埋固定)組織樣品2RNA提取使用特殊試劑從FFPE樣品中提取RNA3RNA質(zhì)控檢查RNA完整性、濃度及純度4建庫針對FFPE樣品特點進行特殊的建庫方案FFPE(Formalin-Fixed,Paraffin-Embedded)樣品是生物醫(yī)學研究中常用的保存組織形態(tài)的方法。由于固定和包埋過程會造成RNA分子的降解,因此FFPE樣品建庫需要采用特殊的流程和試劑來獲得可靠的測序結(jié)果。環(huán)境樣品建庫1樣品來源環(huán)境樣品廣泛存在于土壤、水體、空氣等各種自然環(huán)境中,包括泥沙、粉塵、微生物等。這些樣品蘊含豐富的遺傳信息,對揭示環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)與功能具有重要意義。2樣品特點環(huán)境樣品通常含有雜質(zhì)較多、RNA含量較低等特點,需要采用專門的提取和建庫方法。對于某些難以培養(yǎng)的微生物,環(huán)境測序是獲取其遺傳信息的重要途徑。3建庫關(guān)鍵步驟包括樣品采集與保存、環(huán)境DNA/RNA提取、rRNA去除、cDNA合成、建庫擴增等,每一步都需要特殊的處理手段以確保最終文庫的質(zhì)量。植物樣品建庫1植物組織收集選擇新鮮的莖葉、根系等組織部分2RNA提取采用適合的方法如TRIzol法提取植物總RNA3RNA質(zhì)量檢測確保RNA濃度和純度滿足建庫要求4建庫流程根據(jù)所需試驗類型選擇合適的建庫方法植物樣品的RNA提取與建庫是一個細致的過程。首先要根據(jù)實驗目的選擇合適的組織并小心采集。然后使用TRIzol等化學試劑提取總RNA，檢查其濃度和純度。最后根據(jù)實驗需求選擇合適的建庫方法，如mRNA富集、rRNA去除等，以獲得高質(zhì)量的文庫。動物組織樣品建庫樣品預處理小心保護樣品中的RNA完整性,去除雜質(zhì)和酶?？刹捎靡旱鋬龌騌NA保護試劑。RNA提取選擇適合動物組織的RNA提取試劑盒,遵循操作流程進行總RNA提取。確保獲得高質(zhì)量完整的總RNA。rRNA去除常用的rRNA去除方法有磁珠分離法和核酸雜交法,根據(jù)樣品情況選擇合適的去除技術(shù)。建庫流程根據(jù)實驗需求,選擇合適的建庫策略,如單細胞RNA、有取向性的轉(zhuǎn)錄本建庫等。嚴格控制各步操作。細菌樣品建庫1細菌培養(yǎng)將細菌樣品置于合適的培養(yǎng)基中，在適宜的溫度和條件下培養(yǎng)。這一步確保我們獲取足夠的細菌DNA/RNA用于建庫。2核酸提取采用化學或機械破碎的方法從細菌細胞中分離出核酸分子。提取得到的DNA或RNA需滿足建庫的質(zhì)量要求。3文庫構(gòu)建使用特定的試劑盒和儀器對提取的核酸進行各種酶切、連接、擴增等步驟,構(gòu)建成測序文庫。文庫需要符合測序儀的接口要求。病毒樣品建庫1樣品預處理分離病毒顆粒,溶解病毒基因組2核酸提取使用柱體或磁珠等提取病毒核酸3核酸檢測評估提取的核酸質(zhì)量和濃度4建庫構(gòu)建采用特殊的轉(zhuǎn)錄或擴增方法病毒樣品的建庫流程需要特殊處理,首先要對樣品進行預處理,分離病毒顆粒并溶解病毒基因組。然后使用柱體或磁珠等方法提取病毒核酸,檢測其質(zhì)量和濃度。最后采用轉(zhuǎn)錄或擴增等特殊方法進行建庫構(gòu)建。整個過程需要謹慎操作,確保獲得高質(zhì)量的病毒序列數(shù)據(jù)。外切酶處理11.降解RNA二級結(jié)構(gòu)使用外切酶可以有效降解RNA二級和三級結(jié)構(gòu),有利于后續(xù)反轉(zhuǎn)錄和擴增。22.去除雜質(zhì)干擾外切酶處理可以消除一些DNA、蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì),提高建庫質(zhì)量。33.優(yōu)化擴增效率由于RNA易形成二級結(jié)構(gòu),外切酶處理可以提高反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增的效率。44.提高建庫靈活性外切酶處理能適用于各種樣品類型,為后續(xù)建庫流程提供更多靈活性。二次PCR擴增1第一輪PCR使用隨機引物或特異性引物進行第一輪擴增。2引物設計針對感興趣的目標序列設計合適的引物。3二次擴增基于第一輪的結(jié)果進行更專一的第二輪擴增。4質(zhì)量控制檢查擴增產(chǎn)物的純度和濃度以確保實驗質(zhì)量。二次PCR擴增是在第一輪PCR基礎上進一步優(yōu)化擴增效果的關(guān)鍵步驟。通過設計更針對性的引物并進行專一性擴增，可以大幅提高目標序列的純度和濃度，為后續(xù)的建庫和測序奠定堅實的基礎。建庫質(zhì)量控制在RNA建庫過程中,需要對整個實驗流程進行嚴格的質(zhì)量控制,確保最終獲得高質(zhì)量的文庫。主要包括以下幾個重點內(nèi)容:通過嚴格的質(zhì)量控制,可以保證最終獲得高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù),為后續(xù)的生物信息分析提供可靠的數(shù)據(jù)基礎。建庫文庫濃度測定5ng/μL建庫文庫濃度的常見單位1KnM建庫文庫濃度的另一個常用單位20最佳濃度測序儀上機時理想的建庫文庫濃度范圍2檢測方法使用熒光定量或分光光度計測定建庫文庫濃度準確測定建庫文庫濃度對保證測序數(shù)據(jù)質(zhì)量至關(guān)重要。通常使用熒光定量或分光光度計等方法進行測定,結(jié)果以ng/μL或nM為單位表示。文庫濃度控制在20ng/μL左右為理想范圍,有助于提升測序效率。建庫文庫大小選擇在建庫過程中,文庫大小的選擇非常重要。一般來說,150-350bp的文庫占比最高,為50%左右。而350-500bp和500-800bp的文庫占比分別為30%和20%。合理選擇文庫大小有利于提高測序效率和數(shù)據(jù)質(zhì)量。建庫文庫純化樣品捕獲通過親和力層析捕獲目標RNA片段。磁珠洗滌使用洗滌緩沖液去除雜質(zhì)和未結(jié)合的RNA分子。目標RNA溶出用低離子濃度的緩沖液從磁珠上解離出目標RNA。濃縮純化使用濃縮柱進一步去除溶劑和雜質(zhì),得到高純度RNA樣品。建庫文庫測序1文庫上機樣品文庫就緒后即可上機進行測序。2樣品稀釋根據(jù)測序儀要求進行適量稀釋。3測序儀參數(shù)設置合理設置測序儀參數(shù),確保測序順利進行。4數(shù)據(jù)輸出測序過程完成后,儀器會自動輸出測序數(shù)據(jù)。建庫文庫測序是整個實驗流程的最后一個環(huán)節(jié)。樣品文庫就緒后,需要根據(jù)測序儀的要求進行適當稀釋,并合理設置測序儀參數(shù),以確保測序過程順利進行。測序完成后,儀器會自動輸出原始測序數(shù)據(jù),為后續(xù)的數(shù)據(jù)分析奠定基礎。建庫文庫稀釋10nM濃度2μl體積8μl體積10μl總體積建庫完成后,需要稀釋文庫到適合測序儀上機的濃度。通常情況下,需將建庫文庫稀釋至10nM濃度,并以2μl文庫、8μl稀釋液的總體積10μl進行稀釋。稀釋后的文庫即可用于測序上機。測序儀上機注意事項儀器準備在上機前仔細檢查測序儀狀態(tài),確保試劑、試管等耗材準備齊全,確保實驗環(huán)境潔凈無塵。樣品裝載小心翼翼地將建庫文庫樣品裝載到測序儀上,確保樣品環(huán)境溫度穩(wěn)定,避免污染和損壞。參數(shù)設置根據(jù)不同測序平臺的要求,仔細設置好測序參數(shù),如讀長、測序循環(huán)、掃描等,確保測序質(zhì)量。過程監(jiān)控持續(xù)監(jiān)控測序過程中的各項指標,及時處理可能出現(xiàn)的問題,確保測序順利進行。數(shù)據(jù)分析處理流程1數(shù)據(jù)預處理包括文件格式轉(zhuǎn)換、數(shù)據(jù)清洗、去噪等步驟,確保數(shù)據(jù)質(zhì)量并為后續(xù)分析做好準備。2統(tǒng)計分析運用各種統(tǒng)計方法對數(shù)據(jù)進行分析,如描述性統(tǒng)計、假設檢驗、相關(guān)性分析等,探索數(shù)據(jù)內(nèi)在規(guī)律。3可視化展示使用圖表、圖像等直觀形式呈現(xiàn)分析結(jié)果,幫助觀眾更好地理解數(shù)據(jù)洞見。實驗數(shù)據(jù)解讀與應用數(shù)據(jù)洞察深入分析實驗數(shù)