生物化學(xué)實驗020649

生物化學(xué)實驗

目錄實驗一、酪蛋白的制備

實驗二、酵母蔗糖酶的提取及活力測定

實驗三、考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度

實驗四、DNS-Cl法測定N末端氨基酸

實驗五、凝膠過濾層析分離藍(lán)葡聚糖和重鉻酸鉀實驗六、酵母RNA的分離及組分鑒定實驗七、維生素C的定量測定實驗八、氨基酸紙層析

準(zhǔn)備實驗

（熟悉實驗室規(guī)章制度及注意事項；實驗記錄/報告；基本操作)

1.實驗要求

1）充分做好實驗預(yù)習(xí)，寫預(yù)習(xí)報告；

2）按時進實驗室；

3）認(rèn)真做實驗；

4）實驗記錄必須真實可靠、不得捏造。實驗數(shù)據(jù)要記錄在數(shù)據(jù)本上以備老師查閱；

5）保持實驗室的秩序，不要喧嘩。

2.

關(guān)于實驗報告

要用自己的實驗記錄認(rèn)真地寫出一份實驗報告，不得互相抄襲。實驗報告的內(nèi)容:①

實驗名稱②實驗?zāi)康蘑蹖嶒炘恚ㄒ獙懙煤啙崳茌^復(fù)雜試劑的配方⑤

實驗結(jié)果及其處理

⑦分析討論⑧同組者姓名

標(biāo)準(zhǔn)的實驗報告應(yīng)該簡潔明了地給出使別人能夠重復(fù)你的實驗所需要的全部信息。

3.值日生職責(zé)：衛(wèi)生、水、電、門、窗

4.儀器的愛護：

儀器分發(fā)及損壞賠償責(zé)任

實驗一、酪蛋白的制備

[實驗?zāi)康腯

學(xué)習(xí)從奶粉中制備酪蛋白的原理和方法，并以此加深對等電點概念的印象。

[原理]

奶粉的主要干物質(zhì)成分是酪蛋白——一些含磷蛋白質(zhì)的混合物。酪蛋白的pI為pH4.7。在處于其pI時，兼性離子/粒子在溶液中的溶解度最低；將牛奶的pH調(diào)到pH4.7，就可獲得酪蛋白沉淀；用乙醇、乙醇-乙醚混合物、乙醚來洗滌沉淀物，以去除醇溶性和脂溶性雜質(zhì)，就可得到較純的酪蛋白。

[操作步驟]

40ml每次水洗后（10ml左右/次）離心機試紙10min(4000rpm)25min(4000rpm)10ml4g奶粉+37mL水離心機冷凍離心機高速臺式離心機干燥箱恒溫水浴鍋儀器干燥器實驗二、酵母蔗糖酶的提取及活力測定1.學(xué)習(xí)蔗糖酶分離提取的原理；2.學(xué)習(xí)掌握細(xì)胞破碎及抽提技術(shù)一、酵母蔗糖酶粗制品的提取二、蔗糖酶活力測定

1）細(xì)胞破碎：根據(jù)酶在生物體內(nèi)的分布，可分為胞內(nèi)酶和胞外酶，蔗糖酶系胞內(nèi)酶。提取胞內(nèi)酶時，要破碎組織和細(xì)胞，然后用一定的溶液提取，得到的材料稱為無細(xì)胞抽提液。材料不同，破壁的方法也不同。本實驗酵母細(xì)胞破壁方法是：自溶法，即將菌體放在適當(dāng)?shù)膒H值和溫度下，利用組織細(xì)胞自身的酶系將細(xì)胞壁破壞，使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)釋放出來。自溶時需加少量防腐劑，以防外界細(xì)菌污染。自溶法的缺點是時間較長。

研磨法:10g酵母，加入2-3g硼砂，逐步加入0.2mol/L醋酸鈉緩沖液，pH4.6，充分研磨50-60分鐘。4000轉(zhuǎn)／分離心20分鐘，合并，記錄總體積，此即為蔗糖酶的粗制品。

（留樣用于下次定量實驗）

2）抽提：

抽提是將已破碎細(xì)胞的材料置于一定的條件及溶劑中，使被提取物釋放出來的過程。抽提液可用水或有機溶劑。大部分酶蛋白能溶于水、稀鹽、稀堿或稀酸中。對于普通的酶多采用緩沖液，有利于酶的穩(wěn)定。而一些與脂質(zhì)結(jié)合較牢固的酶，常用有機溶劑提取。抽提時緩沖液的離子強度和pH值以及溫度的選擇，應(yīng)既有利于酶的提取又保證酶的穩(wěn)定。對于不同來源的酶，通常采用鹽析沉淀、吸附層析、離子交換層析、結(jié)晶及各種物理化學(xué)方法提純。純化過程中，應(yīng)盡量避免高溫，劇烈的機械攪拌、強酸、強堿等條件。實驗原理

1）蔗糖酶催化的反應(yīng)：蔗糖D-果糖+D-葡萄糖

2）3，5-二硝基水楊酸比色定糖的原理:

①DNS試劑+還原糖

糖酸+氨基化合物

（天藍(lán)色）

（棕紅色）②在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與反應(yīng)液的顏色強度成一定比例關(guān)系。所以，可用DNS比色法測定還原糖的含量，該方法是半微量定糖法，操作簡便、快速、雜質(zhì)干擾少。

本實驗中規(guī)定:在35℃條件下，每三分鐘能使5%蔗糖溶液水解釋放1毫克還原糖的酶量定為一個活力單位。

沸水浴中強堿性溶液中反應(yīng)式1、試劑：（1）5mmoL/L磷酸鈉緩沖液（pH6.0）（2）0.2mol/L醋酸鈉緩沖液，pH4.6（3）1moL/L氫氧化鈉（4）5%蔗糖（5）3，5-二硝基水楊酸試劑（6）0.1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液2、器材：（1）燒杯、攪拌棒、三角瓶、滴管（2）量筒、移液管、吸耳球、試管（3）天平（4）離心機、內(nèi)外套管（5）冰箱（6）高活性干酵母粉、硫酸紙、皮筋套試劑和器材

操作---葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作和蔗糖酶活力的測定管號含糖量（mg）0.1%葡萄糖（mL）水（mL）DNS(mL)OD54010021.520.20.21.81.530.40.41.61.540.60.61.41.550.80.81.21.561.01.01.01.571.21.20.81.581.41.40.61.591.61.60.41.510對照（2份）0.5(見后操作)1.51.511樣液（3份）0.5(見后操作)1.51.5測定蔗糖酶活力的流程（1）、水解

對照管（2份）

樣液（2份）反應(yīng):

2ml稀釋的酶液×1

×2×52ml稀釋的酶液

于35℃恒溫水浴中預(yù)熱到恒溫35℃

同時于35℃恒溫水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)3min加入0.5ml1mol/L的NaOH

，搖勻，使酶失活加入2ml5%蔗糖液（預(yù)熱至35℃）加入2ml5%蔗糖液（預(yù)熱至35℃）刻度管1刻度管2各加入1.5mlDNS試劑各加入1.5ml蒸餾水同時于沸水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5min用流動的冷水終止反應(yīng)分別用離子水定容至25ml同時于35℃恒溫水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)3min加入0.5ml1mol/LNaOH，搖勻，終止反應(yīng)取出0.5ml取出0.5ml

分別于540nm處測定光吸收值（2）、比色反應(yīng)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：以葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。蔗糖酶活力的測定計算出所有的酶在35℃下，以5％蔗糖為底物時，3分鐘能釋放出的還原糖的總毫克數(shù)，此數(shù)值即為總活力單位。附:722型分光光度計的操作方法及注意事項：

（1）基本部件：

(2)原理：A=εcl（3）操作方法：①接通電源，打開比色皿暗廂蓋，預(yù)熱20分鐘；②旋扭旋至[T]檔，調(diào)節(jié)波長旋扭至所需要的單色光波長，選擇相應(yīng)的放大靈敏度檔，再用零位電位器校正電表指針指在零位；③將裝有空白液和待測液的比色皿依此放入暗廂內(nèi)的比色皿架上，此時空白液應(yīng)位于光路上。蓋上暗廂，使光電管見光，旋轉(zhuǎn)光量調(diào)節(jié)器，使電表指針正確處于100%；④按上述方法連續(xù)幾次調(diào)整零位和使電表指針指在100%，即可進行測定；⑤將旋扭旋至[A]檔，此時，若不為0，則調(diào)節(jié)消光零旋鈕。輕拉比色皿定位裝置的拉桿，使待測溶液進入光路，此時即可直接讀出光吸收值的讀數(shù)。

（2）注意事項：①務(wù)必保持比色皿透光面的清潔，不要用手摸比色皿的光滑面，更不要用毛刷刷洗比色皿，以免影響讀數(shù)的準(zhǔn)確；②比色皿外邊沾有水或待測溶液時，可先用濾紙吸干，再用擦鏡紙擦凈；③把比色皿放入比色皿架時，要注意盡量使它們的位置前后一致。

分光光度計紫外可見分光光度計

實驗三、考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度實驗?zāi)康?/p>

學(xué)習(xí)考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度的原理和方法。實驗原理

考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度是利用蛋白質(zhì)與染料結(jié)合的原理，定量地測定微量蛋白質(zhì)濃度的快速、靈敏的方法?？捡R斯亮藍(lán)G250存在兩種不同的顏色形式，紅色和藍(lán)色。它考馬斯亮藍(lán)通過范德華力與蛋白質(zhì)結(jié)合，在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律。結(jié)合后染料顏色由紅色形式轉(zhuǎn)變成藍(lán)色形式，最大光吸收由465nm變成595nm，通過測定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白的量。蛋白質(zhì)和染料結(jié)合是一個很快的過程，約2分鐘即可反應(yīng)完全，呈現(xiàn)最大光吸收，并可穩(wěn)定1小時。之后，蛋白-染料復(fù)合物發(fā)生聚合并沉淀出來。測定蛋白質(zhì)濃度時靈敏度很高，比Lowry法靈敏4倍，測定范圍為10-100ug蛋白質(zhì)，微量測定范圍是1-10ug蛋白質(zhì)。此法重復(fù)性好，精確度高，線性關(guān)系好。此方法干擾物少。研究表明NaCl,KCl,MgCl2,乙醇,(NH4)2SO4無干擾。強堿緩沖劑在測定中有一些顏色干擾，這可以用適當(dāng)?shù)木彌_液對照扣除其影響。Tris，乙酸，2-巰基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污劑如TritonX-100,SDS,玻璃去污劑有少量顏色干擾，用適當(dāng)緩沖液對照很容易除掉。但是，大量去污劑的存在對顏色影響太大而不易消除。

1.器材試管及試管架吸量管（0.1mL,5mL）分光光度計

2.試劑（1）考馬斯亮藍(lán)試劑:考馬斯亮藍(lán)G250100mg溶于50mL95%乙醇中，加入100mL85%磷酸，用蒸餾水稀釋至1000mL，濾紙過濾。最終試劑中含0.01%（W/V）考馬斯亮藍(lán)G250,4.7%乙醇，8.5%磷酸。（2）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：結(jié)晶牛血清清蛋白，預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，根據(jù)其純度用0.15mol/LNaCl配置成0.1mg/mL蛋白溶液。（3）未知蛋白質(zhì)溶液器材和試劑操作步驟

1.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

試管編號0123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白/mL00.10.20.30.40.50.60.15mol/LNaCl/mL1.00.90.80.70.60.50.4考馬斯亮藍(lán)試劑/mL5.0搖勻，1h內(nèi)以0號試管為空白對照，在595nm處測吸光值A(chǔ)595

2.測定未知樣品蛋白濃度

測定方法同上，取合適體積的未知樣品，使其測定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線范圍內(nèi)。根據(jù)所測定的A595值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的量，從而計算出未知樣品蛋白濃度。

結(jié)果與討論繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線求出未知蛋白濃度1.如果測定要求很嚴(yán)格，可以再試劑加入后5-20分鐘內(nèi)測定光吸收，因為在這段時間內(nèi)顏色最穩(wěn)定。2.測定中，蛋白-染料復(fù)合物會有少部分吸附于比色杯壁上，實驗證明此復(fù)合物的吸附量是可以忽略的。測定完后可用乙醇將藍(lán)色的比色杯洗干凈。注意事項實驗四、DNS-氨基酸的聚酰胺薄膜層析

一、目的學(xué)習(xí)聚酰胺薄膜層析的方法。二、原理

熒光試劑二甲氨基萘磺酰氯即DNS-Cl(Dansyl-Cl)，能與所有氨基酸的氨基結(jié)合，生成熒光物質(zhì)DNS-氨基酸。DNS-Cl也能與蛋白質(zhì)或多肽的游離氨基結(jié)合，生成DNS-蛋白質(zhì)或DNS-肽，經(jīng)酸水解后可釋放出DNS-氨基酸。各種DNS-氨基酸與聚酰胺薄膜形成氫鍵的能力不同，即在溶劑與聚酰胺薄膜之間的分配系數(shù)不一樣，故可用聚酰胺薄膜層析分離各種DNS-氨基酸。檢測靈敏度高（0.01ug），分辨力強，快速方便。

DNS-氨基酸在360nm或280nm波長的紫外光照射下，發(fā)出黃綠色熒光，容易進行檢測。三、器材和試劑1.器材層析缸毛細(xì)管紫外燈烘箱恒溫箱聚酰胺薄膜吹風(fēng)機2.試劑①各種層析純標(biāo)準(zhǔn)氨基酸②DNS-Cl丙酮溶液：稱取25mgDNS-Cl，溶于10mL丙酮中，貯于棕色瓶中，置冰箱保存，一個月內(nèi)穩(wěn)定③0.2mol/LNaHCO3溶液④NaOH1M⑤HCL1M⑥展開溶液I：88％甲酸：水＝1.5:100（V/V）⑦展開溶液Ⅱ：苯：冰醋酸=9:1（V/V）⑧展開溶液Ⅲ：乙酸乙醋：甲醇：冰醋酸=20:1:1（V/V/V）⑨展開溶液Ⅳ：0.05mol/L磷酸三鈉溶液：乙醇＝3:1（V/V）四、操作1．氨基酸的DNS化分別稱取0.2～0.3mg的層析純標(biāo)準(zhǔn)氨基酸以及樣品氨基酸，溶于0.5mL0.2mol/L的NaHCO3溶液中。各取0.1mL于有玻璃塞的試管中，加入0.1mLDNS-Cl丙酮溶液。檢查pH，必要時用NaOH調(diào)pH至9.0—9.5。于室溫（20℃左右）放置2～4h。冷風(fēng)吹除丙酮后，加HCL調(diào)pH2-3水解16-18h，加入乙酸乙酯抽提分層，取上層有機相。2．聚酰胺薄膜的準(zhǔn)備將聚酰胺薄膜剪成7cm×7cm的方塊，在距邊0.5cm處畫互為垂直的二條基線，交叉點為原點。若只做單向?qū)游觯瑒t只畫一條基線，在基線上每隔1cm畫一點樣點。3．點樣用微量注射器或毛細(xì)管取樣，點在點樣位置上，點樣直徑應(yīng)小于2mm。若多次點樣，則點一次，吹干一次。4．展開將點好樣的聚酰胺薄膜卷成圓筒形，樣品側(cè)在筒內(nèi)，箍以線圈固定。放在小層析槽內(nèi)（可在小干燥器內(nèi)置一培養(yǎng)皿代替），槽內(nèi)（培養(yǎng)皿）放人5～10mL展開溶液I，進行展開，以溶劑前沿到達距頂端0.5cm左右為止（約20分鐘）。取出膜片，吹干。進行雙向?qū)游鰰r，在第一向?qū)游鐾戤?，完全吹干后（有時需晾過夜，才能充分吹干），將聚酰胺薄膜片轉(zhuǎn)90°，用展開溶液Ⅱ展開。為了區(qū)分DNS-蘇氨酸、DNS-天冬氨酸與DNS-谷氨酸，可在溶液Ⅱ展開后，吹干，接著用溶液Ⅲ沿同一方向展開，只需展開至一半高度即可。為了區(qū)分ε-DNS-賴氨酸、α-DNS-組氨酸與DNS-精氨酸，應(yīng)在溶劑Ⅱ中展開后，吹干，接著在溶液Ⅳ中沿同一方向展開。5.DNS-氨基酸的檢測展開結(jié)束后，取出薄膜，用吹風(fēng)機吹干，在360nn或280nn的紫外光燈下檢測。DNS氨基酸呈黃綠色熒光。此外還有其他顏色的雜點，如DNS-OH顯藍(lán)綠色熒光等。用樣品的層析譜與標(biāo)準(zhǔn)DNS-氨基酸層析譜相比較，可鑒別樣品DNS-氨基酸的種類。Coverthebeakerwithawatchglass,swirlitgently,andallowittostandwhileyouprepareyourTLCplate.

Usingapencil,drawalineacrosstheplateatthe0.5cmmark.Thisistheorigin:thelineonwhichyouwill"spot"theplate.It'skindofhardtoseethepencillineintheabovephotos,sohereisaclose-upofhowtheplatelooksafterthelinehasbeendrawn.dipthemicrocapintosolution-thearrowpointstothemicrocap,itistinyandhardtosee

makesureitisfilled-holdituptothelightifnecessary

touchthefilledmicrocaptoTLCplatetospotit-makesureyouwatchtoseethatalltheliquidhasdrainedfromthemicrocap

Developtheplate.placetheTLCplateinthedevelopingcontainer-makesurethesolventisnottoodeepThesolventwillriseuptheTLCplatebycapillaryaction.Inthisphoto,itisnotquitehalfwayuptheplate.Inthisphoto,itisabout3/4ofthewayuptheplate.Removetheplatefromthebeaker.quicklymarkalineacrosstheplateatthesolventfrontwithapencilAllowthesolventtoevaporatecompletelyfromtheplate.Ifthespotsarecolored,simplymarkthemwithapencil.herearetwopropersizedspots,viewedunderaUVlamp

(youwouldcirclethesewhileviewingthem)Theplateshowsthreecompoundsrunatthreedifferentconcentrations.Themiddleandrightplateshowreasonablespots;theleftplateisruntooconcentratedandthespotsarerunningtogether,makingitdifficulttogetagoodandaccurateRfreading.

Here'swhatoverloadedplateslooklikecomparedtowell-spottedplates.Theplateonthelefthasalargeyellowsmear;thissmearcontainsthesametwocompoundswhicharenicelyresolvedontheplatenexttoit.TheplatetothefarrightisaUVvisualizationofthesameoverloadedplate.Theretentionfactor,orRf,isdefinedasthedistancetraveledbythecompounddividedbythedistancetraveledbythesolvent.擴展劑A結(jié)果擴展劑B結(jié)果與形成氫鍵能力，及DNS-aa在擴展劑中的溶解度有關(guān)實驗五、凝膠過濾層析

分離藍(lán)葡聚糖和重鉻酸鉀

1.了解凝膠過濾層析的原理及其應(yīng)用

2.初步掌握凝膠過濾層析技術(shù)實驗?zāi)康?/p>

實驗原理

凝膠層析又稱排阻層析，凝膠過濾，滲透層析或分子篩層析等。它廣泛地應(yīng)用于分離、提純、濃縮生物大分子及脫鹽等。凝膠是一種具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)且呈多孔的不溶性珠狀顆粒物質(zhì)。用它來分離物質(zhì)，主要是根據(jù)多孔凝膠對不同半徑的蛋白質(zhì)分子（近于球形）具有不同的排阻效應(yīng)實現(xiàn)的。亦即它是根據(jù)分子大小這一物理性質(zhì)進行分離純化的。凝膠過濾層析的工作原理對于某種型號的凝膠，一些大分子不能進入凝膠顆粒內(nèi)部而完全被排阻在外，只能沿著顆粒間的縫隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由擴散，滲透進入凝膠內(nèi)部的篩孔，爾后又被流出的洗脫液帶走。分子越小，進入凝膠內(nèi)部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先從柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子與小分子之間，只能進入一部分較大的孔隙，亦即部分排阻，因此這些分子從柱中流出的順序也介于大、小分子之間。這樣樣品經(jīng)過凝膠層析后，分子便按照從大到小的順序依次流出，達到分離的目的。動畫器材與試劑

（一）器材

1.玻璃層析柱(20mm×40cm）

2.恒流泵

3.自動部分收集器

4.250ml燒杯（二）試劑

1.藍(lán)葡聚糖－20002.重鉻酸鉀實驗操作

（一）凝膠的溶脹

7gSephadexG-75于250ml燒杯中加入H2O100ml，沸水浴中煮沸2～3小時（可去除顆粒內(nèi)部的空氣及滅菌）,反復(fù)傾瀉去掉細(xì)顆粒。（二）裝柱

1.取潔凈的的玻璃層析柱垂直固定在鐵架臺上。

2.在柱中注入H2O（約1/3柱床高度），將凝膠漿液緩慢傾入柱中，待凝膠沉積約1cm～2cm高度后打開出水口，流速一般用3ml～6ml/10min。膠面上升到柱記號處則裝柱完畢，注意裝柱過程中凝膠不能分層。然后關(guān)閉出水口，靜置片刻，等凝膠完全沉降，則接上恒流泵，用1～2倍床體積的洗脫液平衡柱子，使柱床穩(wěn)定。

(三)上樣

0.1ml樣品加到凝膠柱床表面，洗下殘留樣品。

(四)洗脫打開恒流泵，用水作為洗脫液洗脫，觀察。裝置圖層析裝置

實驗六、酵母RNA的分離及組分鑒定[實驗?zāi)康腯

了解核酸的組分，并掌握鑒定核酸的方法。

[原理]

酵母核酸中RNA含量較多，達2.67-10.0%，DNA含量僅為0.03-0.516%。在細(xì)胞中除了核酸外還有Pr、多糖及其他多種化合物；RNA可溶于堿性溶液，在堿性提取液中加入酸性乙醇溶液可以使RNA析出；稀減法使用稀堿（0.04MNaOH）裂解酵母，然后用酸中和，除去蛋白質(zhì)等的上清液用乙醇沉淀或調(diào)pH2.5，利用等電點沉淀。提取的RNA有不同程度的降解。RNA提取的操作步驟10g干酵母研磨60mlNaOH100ml錐形瓶）沸水浴30m’（攪拌）冷卻后離心4000rpm,10m’。取上清，倒入20ml酸性乙醇中，邊加邊攪，待完全沉淀后，離心（4000rpm,3分鐘）。沉淀用95%乙醇洗2次（每次約10ml），再用無水乙醚洗1次（7ml），洗滌時用細(xì)玻棒小心攪動沉淀。室溫干燥得RNA粗品。

RNA是由核糖、嘌呤/嘧啶堿和磷酸組成的。提取得到的0.1gRNA中加10%硫酸5ml，煮沸10min即可得到水解液，對它們分別進行定性鑒定。①磷酸與鉬酸銨試劑作用產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)(1ml水解液+1mlAgNO3+1ml鉬酸銨→水浴加熱)：(NH4)2MoO4+H3PO4→(NH4)3PO4·12MoO3黃色物質(zhì)②核糖與苔黑