生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課件-3蛋白質(zhì)的鹽析分離和凝膠排阻層析脫鹽

實(shí)驗(yàn)三

蛋白質(zhì)的鹽析分離和

凝膠排阻層析脫鹽鹽析法粗分離蛋白質(zhì)凝膠排阻層析法將鹽和蛋白質(zhì)分開(kāi)紫外分光光度法和醋酸鋇法分別測(cè)定蛋白質(zhì)和鹽離子濃度，鑒定脫鹽是否成功實(shí)驗(yàn)?zāi)康募耙笳莆整}析分級(jí)分離蛋白質(zhì)的原理掌握凝膠排阻層析的原理熟悉鹽析、凝膠排阻層析及紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的操作在蛋白質(zhì)分子表面的親水基團(tuán)附近，水分子形成水化層，有利于蛋白質(zhì)溶解在蛋白質(zhì)分子表面的疏水基團(tuán)附近，水分子極化排列，避免蛋白質(zhì)聚集蛋白質(zhì)分子表面的可解離基團(tuán)在適當(dāng)?shù)膒H條件下，與周?chē)芤褐须姾上喾吹柠}離子間形成穩(wěn)定的雙電層，使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，而蛋白質(zhì)分子與水分子間相互作用增強(qiáng)

蛋白質(zhì)溶解的原理蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度由蛋白質(zhì)周?chē)H水基團(tuán)與水形成水化層的程度,以及蛋白質(zhì)分子帶有電荷的情況決定鹽析沉淀定義

蛋白質(zhì)在高離子強(qiáng)度的溶液中溶解度降低、發(fā)生沉淀的現(xiàn)象原理1.中性鹽比蛋白質(zhì)具有更強(qiáng)的親水性，因此將與蛋白質(zhì)爭(zhēng)奪水分子，使蛋白質(zhì)脫去水化層2.高濃度鹽離子使蛋白質(zhì)表面所帶的電荷被中和，雙電層厚度降低，靜電排斥作用減弱，蛋白質(zhì)的膠體穩(wěn)定性遭到破壞而沉淀析出鹽析的影響因素

蛋白質(zhì)的種類(lèi)：

分子量越大，沉淀所需鹽的量越少（卵球蛋白>卵清蛋白）蛋白質(zhì)分子不對(duì)稱(chēng)性越大，越容易沉淀

溫度：

高離子強(qiáng)度溶液中，升高溫度有利于蛋白質(zhì)的失水沉淀低離子強(qiáng)度溶液或純水中，蛋白質(zhì)的溶解度在一定溫度范圍內(nèi)一般隨溫度升高而增大

pH值：

在接近蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的溶液中進(jìn)行鹽析有利于蛋白質(zhì)的沉淀。需要注意在高鹽溶液中蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)會(huì)發(fā)生偏移鹽析的用鹽要求鹽析作用強(qiáng)足夠大的溶解度，適于低溫操作生物惰性，不會(huì)使蛋白質(zhì)變性密度小且來(lái)源豐富

硫酸銨價(jià)廉，易于提純，鹽析效果好溶解度高（4M）沉淀的高濃度蛋白質(zhì)性質(zhì)穩(wěn)定(2-3M)

阻止蛋白水解

蛋白質(zhì)的層析分離定義：根據(jù)蛋白質(zhì)的形態(tài)、大小和電荷的不同而設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)物理分離方法，又名色譜法。原理：

各種不同的層析方法都包括一個(gè)固定相和一個(gè)流動(dòng)相。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合溶液或氣體(流動(dòng)相)通過(guò)裝有重填材料的管或柱(固定相)時(shí)，由于混合物中各組份在物理化學(xué)性質(zhì)(如吸引力、溶解度、分子的形狀與大小、分子的電荷性與親和力)等方面的差異使各組分在兩相間進(jìn)行反復(fù)多次的分配而得以分開(kāi)固定相：常用交聯(lián)葡聚糖凝膠，如Sephadex系列，有不同凝膠孔徑可供選擇流動(dòng)相：蛋白質(zhì)混合溶液及沖洗緩沖液凝膠排阻層析(分子篩層析、分子排阻層析、凝膠過(guò)濾層析)實(shí)驗(yàn)原理：按照分子量大小依次分離混合蛋白質(zhì)

每個(gè)凝膠珠都有一定孔徑大小。含有不同大小的蛋白質(zhì)混合樣品流入凝膠柱后，大分子量物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠珠內(nèi)部，而沿凝膠珠之間的間隙穿行，迅速流出；小分子量物質(zhì)進(jìn)入凝膠珠內(nèi)部反復(fù)穿行，緩慢流出。固定相流動(dòng)相實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)述通過(guò)鹽析法使雞蛋卵清蛋白和卵球蛋白分離；通過(guò)鹽溶法使沉淀析出的卵球蛋白再次溶解制備葡聚糖凝膠SephadexG-25凝膠排阻層析柱通過(guò)凝膠排阻層析分離卵球蛋白和鹽離子檢測(cè)層析后收集的各管樣品中的鹽離子（醋酸鋇法）檢測(cè)各管樣品中的蛋白質(zhì)含量（UV法）分析結(jié)果：鹽析分離蛋白及凝膠排阻層析脫鹽是否成功？實(shí)驗(yàn)一卵球蛋白的鹽析分離0.7ml卵清+0.7ml飽和硫酸銨溶液（每組2個(gè)EP管）混合均勻（避免產(chǎn)生氣泡）靜置3-5分鐘，蛋白質(zhì)析出3000rpm，離心3分鐘用移液槍去除上清（含卵清蛋白）1ml水充分溶解卵球蛋白沉淀3000rpm,離心3分鐘將兩管上清合并，即為樣品加50%硫酸銨溶液1.5ml洗滌3000rpm，離心3分鐘用移液槍去除上清實(shí)驗(yàn)二凝膠柱的制備和蛋白脫鹽垂直固定層析柱，并安裝乳膠管、止水夾向?qū)游鲋屑尤?/3體積的水，以平衡、排出基質(zhì)和乳膠管中的氣泡；若層析柱流水不暢，應(yīng)反復(fù)正反沖洗柱基質(zhì)??！液面降至基質(zhì)上2cm后，用止水夾關(guān)閉水流將葡聚糖凝膠混懸液緩慢勻速倒入層析柱中，使凝膠自然沉降，柱高25-30cm左右，注意裝填均勻，無(wú)氣泡和裂紋打開(kāi)止水夾，加入1-1.5倍體積的水以平衡層析柱，直至液面到凝膠床表面后關(guān)閉止水夾用滴管均勻上樣，打開(kāi)止水夾，在下端用EP管接住流出液體待蛋白樣品完全進(jìn)入層析柱后，加入水繼續(xù)洗脫蛋白，注意加水速度恒定，以保持洗脫壓強(qiáng)一致。EP管標(biāo)記順序，1.5ml/管收集洗脫液。待鹽離子濃度降為零后，停止洗脫。凝膠柱裝填和使用過(guò)程中，保持凝膠面上有水，否則氣泡進(jìn)入將影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果樣品溶液的濃度大一些好，但粘度不宜大，加樣體積通常為凝膠柱床體積的1%-10%洗脫速度要恒定實(shí)驗(yàn)完畢后，將凝膠全部回收處理，以備下次實(shí)驗(yàn)使用，嚴(yán)禁將凝膠丟棄或倒入水池中凝膠柱的制備和蛋白脫鹽注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)三脫鹽后離子測(cè)定及蛋白濃度測(cè)定測(cè)定分步收集的樣品液（1.5ml樣品+1.5mlH2O）的A280吸光度，繪制蛋白脫鹽洗脫曲線2.蛋白濃度測(cè)定

醋酸鋇與溶液中的硫酸根離子可以形成白色的沉淀，同時(shí)不能同蛋白質(zhì)形成沉淀。1.硫酸根離子濃度測(cè)定（決定是否停止洗脫）

從每管洗脫液中取1滴加在黑瓷板上，加入1滴醋酸鋇溶液，觀察沉淀實(shí)驗(yàn)中設(shè)陰性對(duì)照(雙蒸水)和陽(yáng)性對(duì)