DB12T 504-2014 水稻轉(zhuǎn)基因成分篩查方法

DB12DB12/T504—2014水稻轉(zhuǎn)基因成分篩查方法Screeningmethodforgeneticallymodifiedrice2014-04-22發(fā)布2014-07-20實施天津市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB12/T504—20141DB12/T504—2014本標準規(guī)定了水稻中轉(zhuǎn)基因成分定性PCR篩查的術(shù)語本標準適用于水稻及其制品中SPS基因、CaMV35S啟動子、NOS終止子、Bt基因、NPTII基因和HPT基因的定性PCR篩查檢測。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格NY/T672轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測通用要求農(nóng)業(yè)部1485號公告—4—2010轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測農(nóng)業(yè)部2031號公告—19—2013轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測抽樣SPS基因SPSgeneCaMV35S啟動子35Spromoterfromcauliflowermosaicvirus（CaMV）NOS終止子terminatorofnopalinesynthase（NOS）geneBt基因Bt（Bacillusthuringiensis）gene），NPTII基因NPTIIgene來源于大腸桿菌（Escherichiacoli），編碼新霉HPT基因HPTgene來自大腸桿菌或鏈球菌（Streptomyceshygroscopicus編碼潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（hygromycin2DB12/T504—20144檢測方法4.1.1實驗用水為重蒸餾水或符合GB/），注：溴化乙錠有致癌作用，配制和使用時應(yīng)戴加入70mL水中，再加入適量氫氧化鈉溶液（4.），）：）：），用水稀釋成1×TAE。4.1.13引物：水稻內(nèi)標準基因和轉(zhuǎn)基因水稻SPS287bpCaMV35S35S-F：5′-GCTCCTACAAATGCC35S-R：5′-GATAGTGGGATTGTGNOSNOS-F：5′-GAATCCTGTTGCCGGTCTTGNOS-R：5′-TTATCCTAGTTTGCGCGCTABtNPTIINpt-F：5’-ACTGGGCACAACAGACAATCG-3’Npt-R：5’-GCATCAGCCATGATGGATACTTT-3’289bpHPThpt-F：5’-GAAGTGCTTGACATTGGGGAGT-3’hpt-R：5’-AGATGTTGGCGACCTCGTATT-3’472bpDB12/T504—2014R水 2.5μL25mmol/L氯化鎂溶液2.0μL0.5～2.5μL4DB12/T504—20140.2～0.5μmol/L0.5～2.5μL0.025U/μL——2.0μL25.0μL檢測反應(yīng)體系中，上下游引物分別是Bt-F和Bt-R，引物系中，上下游引物分別是Npt-F和Npt-R，引物終濃度分別為0.2μmol/L；HPT基因PCR檢測反應(yīng)SPSNOSBtNPTIIHPT4.3.5.1.5反應(yīng)結(jié)束后取出PCR管，對PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行電泳檢測。以非轉(zhuǎn)基因水稻基因組DNA作為陰性對照；以含有SPS、CaM5DB12/T504—2014mL瓊脂糖溶液中加入5μLEB溶液，混勻，稍適冷卻后，將其倒入電泳板上，插上梳板，室溫下凝固成凝膠后，放入1×TAE緩沖液中，垂直向上輕輕拔去梳板。取12μL件下電泳檢測。致，而在陰性對照中僅擴增出內(nèi)標準基因片段，空白對照中沒有任何擴增片段，表明P常。否則表明PCR反應(yīng)體系不正常，需要查找原因重新檢測。S基因、CaMV35S啟動子、NOS終止子、小與預(yù)期片段大小不一致，表明試樣中未檢測出轉(zhuǎn)基因成分。結(jié)果表述為“試樣中未檢測出CaMV35S啟動子、NOS終止子、Bt基因、NPTII基因和HPT基因，檢測結(jié)果為陰性”。S啟動子、NOS終止子、Bt基因、NPTII基因和HPT基因中任何一個得到擴增，且擴增片段大小與預(yù)期DB12/T504—2014A.2CaMV35S啟動子PCR擴增產(chǎn)物核苷酸序列