DB12T 1189-2023 牛親子鑒定技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.30CCSB4312TechnicalspecificationforparentageidentificationIDB12/T1189—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由天津市農(nóng)業(yè)農(nóng)村委員會(huì)提出并歸口。本文件起草單位：天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院。本文件主要起草人：馬毅、趙欣、陳麗麗、張漫、譚冬飛、趙康、蘆娜、王麗學(xué)。1DB12/T1189—2023牛親子鑒定技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了牛親子鑒定的技術(shù)方法。本文件適用于牛（Bostaurus）親子鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法GB/T27642牛個(gè)體及親子鑒定微衛(wèi)星DNA法NY/T1672綿羊多胎主效基因FecB分子檢測(cè)技術(shù)規(guī)程SN/T1193基因檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1等位基因數(shù)allele，A反映群體遺傳變異大小的一個(gè)指標(biāo)，其數(shù)值越接近所檢測(cè)到的等位基因的絕對(duì)數(shù)，表明等位基因在群體中分布越均勻。3.2期望雜合度heterogosity，He期望雜合度主要是根據(jù)種群內(nèi)當(dāng)前優(yōu)勢(shì)等位基因的分布頻率來(lái)推算的，稀有基因的貢獻(xiàn)極其微弱。3.3多態(tài)信息含量polymorphicinformationcontent，PICDNA的多態(tài)性指標(biāo)。Pi和Pj分別為第i個(gè)和第j個(gè)等位基因頻率，n為等位基因數(shù)。3.4排除概率PE在親子鑒定中一個(gè)隨機(jī)的個(gè)體被排除為親生父親的概率，是評(píng)價(jià)微衛(wèi)星標(biāo)記在親子鑒定中實(shí)用價(jià)值大小的一個(gè)指標(biāo)。2DB12/T1189—2023(1)當(dāng)沒(méi)有另一親本信息時(shí)，排除子代與假設(shè)親本是親子關(guān)系的排除概率：(2)累計(jì)排除概率：CPE=1-(1-P1)(1-P2)…(1-Pk)3.5微衛(wèi)星DNAmicrosatellite又稱短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）或簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR一類廣泛存在于真核生物基因組中的，核心序列為2～6bp，重復(fù)次數(shù)通常為15～30次的DNA串聯(lián)重復(fù)序列。3.6多重聚合酶鏈反應(yīng)multiplexPCR又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，在同一PCR反應(yīng)體系中加入兩對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)。4鑒定原理利用常染色體微衛(wèi)星分型技術(shù)，選取不同染色體上的微衛(wèi)星位點(diǎn)，采用多重PCR技術(shù)擴(kuò)增微衛(wèi)星標(biāo)記，檢測(cè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性，分型得出各位點(diǎn)等位基因的大小，通過(guò)軟件統(tǒng)計(jì)分析，確定或排除親子關(guān)系。5試劑配制水為符合GB/T6682的一級(jí)水；高壓滅菌條件為1.034×105Pa壓力，蒸汽滅菌20min。試劑配制如——ACD抗凝劑：檸檬酸0.48g、檸檬酸鈉1.32g、葡萄糖1.47g，定容于100mL水中，高壓滅菌；——10%SDS（十二烷基硫酸鈉）：100gSDS溶于90mL水中，加熱至68℃助溶，用HCl調(diào)pH至7.2，定容至1000mL，0.2μm的濾膜過(guò)濾，高壓滅菌；——PBS（磷酸緩沖液）：8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4、0.24gKH2PO4溶于800mL蒸餾水中，用HCl調(diào)pH至7.4，加水定容至1000mL，高壓滅菌，室溫保存；——0.5mol/LNaCl（氯化鈉）：5.844gNaCl溶于雙蒸水中，加水定容至200mL，高壓滅菌；——蛋白酶K（20mg/mL）：200mg蛋白酶K定溶于10mL水中，以1mL分裝，-20℃冷凍保存；——氯仿：異戊醇（24：1）：異戊醇2mL加入到500mL的氯仿試劑瓶中，混勻；——1mol/LTris-HCl（pH=8）：將121.1gTris溶于800mL水中，加濃鹽酸調(diào)pH至8.0，容至1000mL，高壓滅菌；——0.5mol/LEDTA（pH=8）：800mL水中加入186.1gEDTA-Na2·2H2O（二水合乙二胺四乙酸二鈉），在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至8.0，然后容至1000mL，高壓滅——TE緩沖液：取1mol/LTris-HCl（pH=8）10mL，0.5mol/LEDTA（pH=8）2mL，加水定容至1000mL，高壓滅菌，室溫保存；3DB12/T1189—2023——血樣裂解液：1mol/LTris-HCl（pH=8）1mL，0.5mol/LEDTA（pH=8）20mL，10%SDS5mL，雙蒸水74mL；——精子DNA抽提液：稱取二硫蘇糖醇0.06g與1mL0.5mol/LTris-HCl，0.5mol/LEDTA，0.5mol/LNaCl，2mL10%SDS混合后，補(bǔ)水至10mL；——50×TAE緩沖液：Tris-base242g，冰乙酸57.1mL，0.5mol/LEDTA（pH=8）100mL，加水定容至1000mL。使用時(shí)稀釋50倍或100倍即1×TAE；——2%瓊脂糖：2g瓊脂糖充分溶解于50×TAE，定容至100mL；——瓊脂糖電泳上樣緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)；0.25%二甲苯菁FF；40%蔗糖水溶液；——10×Buffer：0.05%色素溴酚藍(lán)；——MgCl2（50mmol/L）：分子量為95.211，計(jì)算配制所需固體溶質(zhì)的質(zhì)量，用托盤天平稱取固體MgCl2加入一級(jí)水溶解；——dNTP（10mmol/L）：dNTP溶于pH為7.0的NaOH貯存液中，最初的貯存液可稀釋到10mol/L，分裝后存放在-20℃冰箱中；——TaqDNA聚合酶：TaqDNA聚合酶長(zhǎng)為832個(gè)氨基酸,分子量為94Kd。該酶可以廣泛用于PCR、RT-PCR和加尾反應(yīng)等；——GoldView：可代替溴化乙錠（EB）的新型核酸染料；——6×DNALoadingBuffer：0.05%色素溴酚藍(lán)；0.05%二甲苯菁FF；——2000bpDNAMarker：2000DNAMarker是由2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp以及100bp共6條線狀雙鏈DNA片段組成，保存于1×DNALoadingBuffer中，可直接用于電泳分析；——去離子甲酰胺：產(chǎn)品規(guī)格：100mL，分子式：CH3NO，分子量：45.04；——四甲基羅丹明（TAMRA）：溶劑：DMSO，儲(chǔ)存條件20。C干燥避光保存有效期為12個(gè)月。6儀器設(shè)備6.1單道可調(diào)移液器0.25～2.5μL、1～10μL、2～20μL。6.2基因擴(kuò)增儀溫度范圍0～99℃,樣品規(guī)格96×0.2mL，反應(yīng)體積10～100μL。6.3離心機(jī)最高轉(zhuǎn)速12000r/min，最大容量24×1.5mL。6.4恒溫振蕩器0～200r/min，0～60℃。6.5電子天平萬(wàn)分之一精度。6.6旋渦混合器轉(zhuǎn)速2800r/min，工作臺(tái)直徑110mm。4DB12/T1189—20236.7手持式均質(zhì)器轉(zhuǎn)速范圍5000～35000rpm，處理量0.05～100ml。6.8紫外分光光度計(jì)波長(zhǎng)范圍200～1000nm。6.9凝膠成像分析系統(tǒng)有膠像素1280×1024，檢測(cè)靈敏度DNA≥0.05ng。6.10穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀輸出電壓0～600V，輸出電流0～100mA。6.11水平電泳槽外形尺寸182mm×85mm×5mm，凝膠板面積60mm×60mm。6.12高壓滅菌鍋使用溫度范圍45～135℃,最高使用壓力0.255Mpa。6.13自動(dòng)雙重純水蒸餾器功率3000W，出水量2500mL/h。6.14微波爐容積20L。6.15干燥箱溫控范圍50～300℃,箱內(nèi)尺寸350mm×350mm×450mm。6.16冰箱7檢測(cè)方法7.1樣本采集與保存靜脈采集血樣3～5mL，復(fù)方枸櫞酸鈉注射液（ACD）抗凝，4℃可以保存3～5d，-20℃可以保存一個(gè)月，-80℃可以保存一年。對(duì)公牛，亦可采集2～3劑細(xì)管精液，液氮保存。7.2DNA提取按GB/T27642規(guī)定的方法執(zhí)行。7.3DNA濃度和純度檢測(cè)按NY/T1672的規(guī)定執(zhí)行。5DB12/T1189—20237.4引物序列引物序列參考聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）和國(guó)際動(dòng)物遺傳學(xué)會(huì)（ISAG）的推薦引物。9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分為4個(gè)擴(kuò)増組合，具體按照附錄A。7.5PCR擴(kuò)増7.5.1多重PCR擴(kuò)増?bào)w系產(chǎn)物擴(kuò)增分4次PCR反應(yīng)完成。同一擴(kuò)増組合的引物加入同一PCR反應(yīng)管中，25μL反應(yīng)體系：10×Buffer2.5μL、50mmol/LMgCl21.2μL、10mmol/LdNTP0.6μL、TaqDNA聚合酶2μL、10μmol/L引物（擴(kuò)増組合）各1.0μL、待測(cè)個(gè)體模板DNA（或者陽(yáng)性對(duì)照DNA）100ng、加一級(jí)水至反應(yīng)總體積為25μL。PCR擴(kuò)增時(shí)設(shè)計(jì)陰性對(duì)照（一級(jí)水作為模板）。7.5.2PCR擴(kuò)増條件94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，57～60.5℃退火30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。7.6PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)7.6.1先用水清洗制膠板，再用1×TAE沖洗一次，水平放置。7.6.2根據(jù)電泳膠板的規(guī)格和檢測(cè)樣品的數(shù)量，配制2%的瓊脂糖溶液，在微波爐中加熱融化至溶液澄清透明，室溫下冷卻至60℃時(shí)，加入goldview并混勻，使goldview的終濃度為0.5μg/L。7.6.3將混合液緩慢倒入制膠板中，排除氣泡，插入多齒梳子。待凝膠凝固后，拔出梳子，將凝膠轉(zhuǎn)移至水平電泳槽中，往電泳槽中加入1×TAE緩沖液，使電泳緩沖液沒(méi)過(guò)膠面。7.6.4將待檢PCR產(chǎn)物5μL和上樣緩沖液（6×DNALoadingBuffer）以5：1的比例混合均勻，加入點(diǎn)樣孔；同時(shí)選擇點(diǎn)樣孔點(diǎn)上5μL2000bpDNAMarker作參照。恒壓100V，電泳30min。電泳結(jié)束后于凝膠成像系統(tǒng)觀察，并分析記錄。7.7微衛(wèi)星DNA多態(tài)性分析PCR產(chǎn)物、去離子甲酰胺和TAMRA內(nèi)標(biāo)按0.5μL：10μL：0.5μL比例混合，95℃變性15min，遺傳分析儀測(cè)序，配套軟件分析微衛(wèi)星的基因型。FAM、HEX和TANRA分別表示藍(lán)色、綠色和黑色。8結(jié)果判定8.1多重PCR產(chǎn)物檢測(cè)若多重PCR均出現(xiàn)清晰條帶，表明產(chǎn)物擴(kuò)增成功，可以進(jìn)行測(cè)序，見(jiàn)圖1。6DB12/T1189—2023圖1多重PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳圖8.2微衛(wèi)星標(biāo)記分型利用遺傳分析儀對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行基因分型。檢測(cè)個(gè)體的9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的基因分型結(jié)果，根據(jù)相對(duì)熒光強(qiáng)度和片段大小，可獲得待測(cè)個(gè)體不同STR標(biāo)記的基因型。不同親緣關(guān)系的個(gè)體，其微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因大小不同，表現(xiàn)出不同的基因型，陽(yáng)性對(duì)照樣品9個(gè)STR標(biāo)記不同等位基因的大小按附錄B所示。8.3親子關(guān)系判定根據(jù)待檢個(gè)體STR標(biāo)記的基因型，計(jì)算其等位基因數(shù)（A）、期望雜合度（He）和多態(tài)信息含量（PIC）等指標(biāo)分析微衛(wèi)星標(biāo)記多態(tài)性，計(jì)算累積非父排除概率（CPE）分析標(biāo)記的親子鑒定效力（按照附錄C）。根據(jù)孟德?tīng)栠z傳定律以及STR位點(diǎn)分型來(lái)判斷親子關(guān)系，如果兩者之間孟德?tīng)栧e(cuò)誤的位點(diǎn)數(shù)是0，則判斷為親子關(guān)系。9廢棄物處理按照NY/T1672的規(guī)定執(zhí)行。10交叉污染防止措施按照SN/T1193的規(guī)定執(zhí)行。7DB12/T1189—2023微衛(wèi)星基因座及其引物序列微衛(wèi)星基因座及其引物序列見(jiàn)表A.1。表A.1微衛(wèi)星基因座及其引物序列1GCTTTCAGAAATAGTTTGCATCTTCACATGATAT