鱖魚傳染性脾腎壞死病診斷及綜合防控技術(shù)規(guī)程

PAGE2PAGE6鱖魚傳染性脾腎壞死病診斷及綜合防控技術(shù)規(guī)程范圍本文件規(guī)定了鱖魚傳染性脾腎壞死病的診斷、綜合防控和記錄。本文件適用于鱖魚傳染性脾腎壞死病毒的檢測，鱖魚傳染性脾腎壞死病的診斷和綜合防控。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB11607漁業(yè)水質(zhì)標準SC/T7103水生動物產(chǎn)地檢疫采樣技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義本文件無術(shù)語和定義。4診斷4.1現(xiàn)場調(diào)查水質(zhì)情況包括水源、水色、水溫、透明度、pH、亞硝酸鹽、氨氮、溶解氧、硬度等；養(yǎng)殖情況包括養(yǎng)殖密度、苗種來源、餌料魚來源等。4.2臨床診斷患病魚表現(xiàn)為沿池邊漫游而死，鰓蓋、口腔周圍、下頜、胸鰭、腹鰭充血，鰓發(fā)白，解剖后肝臟呈現(xiàn)白色或有出血點，腎臟和脾臟腫大或有明顯的出血點，部分膽囊腫大，部分幽門盲囊出血（圖1）。4.3檢測方法4.3.1試劑材料無水乙醇（分析純）；三氯甲烷（分析純）；異戊醇（分析純）；1mmol/LEDTA，pH8.0；1%SDS；ddH2O；10mmol/LTris-HCl，pH8.0，4℃保存；Tris飽和酚，4℃保存；8U/μLBstDNA聚合酶，-20℃保存；10mmol/LdNTPs混合物（dATP、dTTP、dCTP、dGTP各2.5mmol/L），-20℃保存；10000×SYBRGreenI，-20℃保存；25mmol/LMgCl2，-20℃保存；10×Thermopolbuffer，-20℃保存；甜菜堿，-20℃保存；10×PCRBuffer，-20℃保存；5U/μLTaqDNAPolymerase，-20℃保存；20mg/mL蛋白酶K，-20℃保存；LAMP檢測引物序列：F3：5′-AACCACCAGGCAGAAATGG-3′B3：5′-ATCCGAGGCGACGTCATC-3′FIP：5′-TAAAGCCAAAGCCCACATCGGCGAAGACATGGTGCGCTACT-3′BIP：5′-AAGCAAGTGCACAGCACCCGTCAAGCCTCGCACAGAGG-3′巢氏PCR檢測引物序列：MCP-F1：5′-ATGTCTGCAATCTCAGGT-3′MCP-R1：5′-TTACAGGATAGGGAAGCCTG-3′MCP-F2：5′-GCGTTTGATGCGATGGAGAC-3′MCP-R2：5′-ACGGCAGAGACACGGTAGGC-3′4.3.2儀器設(shè)備滅菌鍋；水浴鍋；PCR儀；紫外分光光度計；電泳儀；電泳槽；凝膠成像系統(tǒng)；離心機。4.3.3采樣采集樣品的數(shù)量參見SC/T7103水生動物產(chǎn)地檢疫采樣技術(shù)規(guī)范。鱖魚體表用75%酒精消毒后解剖剪解剖，無菌操作，剪取小塊腎臟、脾臟、肝臟，勻漿后用于DNA提取。4.3.4檢測樣本模板制備利用酚-氯仿法抽提混合組織DNA。每個樣品取組織100mg~200mg，勻漿后置于1.5mL微量離心管，加入含蛋白酶K的裂解液（10mmol/LTris-HCl，pH8.0；1mmol/LEDTA，pH8.0；1%SDS），60℃消化1h~3h。用Tris飽和酚：三氯甲烷：異戊醇（25：24：1）混合液提取、純化DNA，-20℃冷凍的無水乙醇沉淀DNA，自然干燥，溶于滅菌ddH2O。紫外分光光度計測定DNA濃度和純度，X脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。DNA樣品置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.3.5環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）檢測方法4.3.5.1LAMP擴增按表1加入各項試劑進行LAMP擴增，同時以ddH2O為模板作陰性對照，以病毒質(zhì)粒作陽性對照，LAMP的反應(yīng)條件：65℃保持60min，80℃終止反應(yīng)10min。

表1LAMP反應(yīng)體系（25μL）試劑體積（μL）DNA模板2內(nèi)引物（FIP、BIP）各1外引物（F3、B3）各1dNTPs（10mmol/L）2.510×Thermopolbuffer2.5甜菜堿（5mol/L）4MgCl2（25mmol/L）2BstDNA酶（8000U）1ddH2O補足至254.3.5.2LAMP檢測結(jié)果判斷將1μL10000×SYBRGreenI熒光染料加入LAMP反應(yīng)產(chǎn)物，振蕩后觀察混合液顏色，綠色為陽性，橙色為陰性（圖2）。4.3.6巢式PCR檢測方法4.3.6.1PCR擴增按表2加入試劑進行第一輪PCR擴增，同時以ddH2O為模板作陰性對照，以病毒質(zhì)粒作陽性對照，PCR的反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min、94℃變性30s、58℃退火30s、72℃延伸1min，循環(huán)30次后72℃延伸10min。表2第一輪擴增反應(yīng)體系（25μL）試劑體積（μL）DNA模板1MCP-F10.5MCP-R10.510×PCRBuffer2.5MgCl2（25mmol/L）2dNTPs（10mmol/L）1TaqDNAPolymerase（5U/μL）0.5ddH2O補足至25按表3加入試劑進行第二輪PCR擴增，以ddH2O為模板作陰性對照，以病毒質(zhì)粒作陽性對照，PCR的反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min、94℃變性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s、循環(huán)30次后72℃延伸10min。

表3第二輪擴增反應(yīng)體系（25μL）試劑體積（μL）DNA模板（第一輪PCR擴增產(chǎn)物）1MCP-F20.5MCP-R20.510×PCRBuffer2.5MgCl2（25mmol/L）2dNTP（10mmol/L）2TaqDNAPolymerase（5U/μL）0.5ddH2O補足至254.3.6.2巢氏PCR檢測結(jié)果判斷反應(yīng)結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物，用1%X脂糖凝膠進行電泳分析，采用凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果，第一輪陽性擴增片段的大小為1362bp，第二輪陽性擴增片段的大小為526bp，陰性無擴增片段（圖3）。4.3.7綜合判定結(jié)合現(xiàn)場調(diào)查、臨床癥狀和分子生物學(xué)檢測結(jié)果，診斷結(jié)論如下：a）有臨床癥狀，分子診斷陽性的，判定鱖魚患傳染性脾腎壞死?。籦）無臨床癥狀，分子診斷陽性的，判定鱖魚攜帶傳染性脾腎壞死病毒；c）無臨床癥狀，分子診斷陰性的，判定鱖魚未患傳染性脾腎壞死病。5綜合防控5.1養(yǎng)殖前準備工作5.1.1養(yǎng)殖用水水源應(yīng)符合GB11607漁業(yè)水質(zhì)標準。5.1.2池塘準備5.1.2.1池塘清整冬季在捕撈后，排干池水，維修堤埂灘腳，并清除池底過多淤泥及池邊雜草，曬池和凍池。5.1.2.2生石灰清塘a）干法清塘：池塘留水6cm9cm，用10kg/100m230kg/100m2生石灰清塘；b）帶水清塘：按20kg/100m350kg/100m3生石灰化漿后全池潑灑。5.1.2.3漂白粉清塘漂白粉含有效氯≥28%。a）干法清塘：用量1kg/100m23kg/100m2；b）帶水清塘：用量2kg/100m35kg/100m3，先將漂白粉加水溶化后，立即全池潑灑。5.1.3苗種檢疫苗種放養(yǎng)前進行傳染性脾腎壞死病毒檢測。5.1.4疫苗注射鱖魚苗種下塘前，按照說明書注射國家批準的鱖傳染性脾腎壞死病滅活疫苗（NH0618株）。5.1.5苗種放養(yǎng)苗種放養(yǎng)前，先放“試水魚”，確認安全后，按照生產(chǎn)計劃放養(yǎng)。5.2養(yǎng)殖過程管理5.2.1水質(zhì)調(diào)控鱖魚養(yǎng)殖池塘水體溶解氧宜≥5mg/L，透明度宜≥30cm，pH值宜7.58.5，每隔10d15d，使用生物型底質(zhì)改良劑和水質(zhì)改良劑各1次。5.2.2餌料投喂投喂的餌料魚不攜帶傳染性脾腎壞死病毒，規(guī)格不超過鱖魚全長的50%，投喂前用3%5%食鹽水浸泡10min15min消毒。疾病高發(fā)期管理水溫25℃30℃時為鱖魚傳染性脾腎壞死病發(fā)病高峰期，每10d用微生物制劑調(diào)節(jié)水質(zhì)進行預(yù)防；疾病發(fā)生后及時撈除病魚及死魚，無害化處理；減少或停止投喂餌料；使用聚維酮碘等藥物對水體消毒1次2次，防止交叉感染。6記錄詳細記錄實際防控措施，記錄保存2年以上。記錄內(nèi)容應(yīng)包含苗種及餌料魚來源、用藥量、用藥方法、病魚死亡情況等。實際操作與復(fù)核人員需在記錄上簽字。

附錄（資料性）圖1鱖魚傳染性脾腎壞死病臨床癥狀圖1鱖魚傳染性脾腎壞死病臨床癥狀A(yù)：鰓蓋、口腔周圍、下頜出血；B：鰓絲發(fā)白；C：肝臟發(fā)白；D：膽囊腫大；E：腎臟腫大；F：脾臟腫大圖2鱖魚傳染性脾腎壞死病毒LAMP檢測結(jié)果圖2鱖魚傳染性脾腎壞死病毒LAMP檢測結(jié)果1：陽性樣本；2：陽性對照；3：陰性對照圖3鱖魚傳染性脾腎壞死病毒巢氏