DB32T-傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處置技術(shù)規(guī)范 第10部分：病毒類應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)

Q/LB.□XXXXX-XXXXDB32/TXXXX—XXXX目次TOC\o"1-1"\h前言 II引言 III1范圍 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語(yǔ)和定義 14生物安全要求 15準(zhǔn)備工作和質(zhì)量控制 16分子生物學(xué)應(yīng)急檢測(cè)技術(shù) 27免疫學(xué)應(yīng)急檢測(cè)技術(shù) 2參考文獻(xiàn) 4前言本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件是DB32/TXXX《傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處置技術(shù)規(guī)范》的第10部分。DB32/TXXX已經(jīng)發(fā)布了以下部分：——第1部分：監(jiān)測(cè)預(yù)警；——第2部分：事件報(bào)告和管理；——第3部分：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估；——第4部分：現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查；——第5部分：恢復(fù)評(píng)估；——第6部分：應(yīng)急消毒處置及應(yīng)急人員個(gè)人防護(hù)；——第7部分：媒介生物應(yīng)急監(jiān)測(cè)、評(píng)估與控制；——第8部分：標(biāo)本的采集、保存和運(yùn)輸；——第9部分：應(yīng)急檢測(cè)流程；——第10部分：病毒類應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)；——第11部分：細(xì)菌類應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由江蘇省衛(wèi)生健康委員會(huì)提出并組織實(shí)施。本文件由江蘇省衛(wèi)生健康標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本文件起草單位：江蘇省疾病預(yù)防控制中心、南京市疾病預(yù)防控制中心、鹽城市疾病預(yù)防控制中心。本文件主要起草人：付建光、樊歡、鄧斐、李志鋒、王慎驕、王楠、許曉慶、余慧燕、李楚楚、秦圓方、田華、祁賢、彭杰夫、崔侖標(biāo)。引言傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件是江蘇省公共衛(wèi)生安全的主要威脅，對(duì)社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和人群健康造成巨大影響。本文件為貫徹落實(shí)《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》《中華人民共和國(guó)突發(fā)事件應(yīng)對(duì)法》《突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急條例》等法律法規(guī)對(duì)傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件的應(yīng)急處置要求，提升江蘇省傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件的應(yīng)急處置能力，保障人民群眾的生命安全和社會(huì)穩(wěn)定的目標(biāo)而制定。DB32/TXXX《傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處置技術(shù)規(guī)范》分為以下11個(gè)部分：——第1部分：監(jiān)測(cè)預(yù)警；——第2部分：事件報(bào)告和管理；——第3部分：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估；——第4部分：現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查；——第5部分：恢復(fù)評(píng)估；——第6部分：應(yīng)急消毒處置及應(yīng)急人員個(gè)人防護(hù)；——第7部分：媒介生物應(yīng)急監(jiān)測(cè)、評(píng)估與控制；——第8部分：標(biāo)本的采集、保存和運(yùn)輸；——第9部分：應(yīng)急檢測(cè)流程；——第10部分：病毒類應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)；——第11部分：細(xì)菌類應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)。DB32/TXXX的制定是對(duì)傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件處置工作相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的有力補(bǔ)充，為開(kāi)展傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件的監(jiān)測(cè)預(yù)警、報(bào)告和管理、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查、恢復(fù)評(píng)估、應(yīng)急消毒處置和個(gè)人防護(hù)、媒介生物的應(yīng)急監(jiān)測(cè)評(píng)估與控制、標(biāo)本的采集和檢測(cè)等應(yīng)急處置工作提供有力的科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐，對(duì)保障公眾健康和公共衛(wèi)生安全具有重要意義。傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處置技術(shù)規(guī)范第10部分：病毒類應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)范圍本文件規(guī)定了傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處置中病毒類應(yīng)急檢測(cè)的生物安全要求、準(zhǔn)備工作和質(zhì)量控制、分子生物學(xué)應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)和免疫學(xué)應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)等。本文件適用于傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處置中病毒類傳染病病原體的應(yīng)急檢測(cè)。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求WS233病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全通用準(zhǔn)則術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

高通量測(cè)序high-throughputsequencing又稱下一代測(cè)序技術(shù)（Next-generationsequencing,NGS），或大規(guī)模平行測(cè)序（Massivelyparallelsequencing，MPS）。區(qū)別于傳統(tǒng)Sanger（雙脫氧法）測(cè)序，能夠一次并行對(duì)大量核酸分子進(jìn)行平行序列測(cè)定的技術(shù)，通常一次測(cè)序反應(yīng)能產(chǎn)出不低于100兆的測(cè)序數(shù)據(jù)。生物安全要求實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)根據(jù)GB19489和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的要求，配備不同類型傳染病感染的個(gè)人防護(hù)裝備，包括但不限于防護(hù)服、手套、外科口罩或醫(yī)用防護(hù)口罩、防護(hù)面屏、防護(hù)帽。防護(hù)服宜每隔4h更換一次。在發(fā)生意外暴露時(shí)，根據(jù)應(yīng)急處置預(yù)案采取必要措施。實(shí)驗(yàn)人員、實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所、感染性標(biāo)本處置及消毒滅菌等應(yīng)符合WS233中的實(shí)驗(yàn)室生物安全管理要求。依據(jù)《醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例》規(guī)定處置醫(yī)療廢物。準(zhǔn)備工作和質(zhì)量控制準(zhǔn)備工作根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，準(zhǔn)備相應(yīng)的生物安全柜、移液器、漩渦震蕩儀、離心機(jī)等儀器和檢測(cè)試劑耗材。標(biāo)本震蕩后瞬時(shí)離心取上清用于病毒類核酸提取及抗原檢測(cè)。按照病毒RNA/DNA核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，取適量標(biāo)本進(jìn)行核酸提取，提取完成后應(yīng)立即封蓋并馬上進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)。剩余的標(biāo)本和核酸應(yīng)于-80℃條件下凍存。質(zhì)量控制每一批次反應(yīng)過(guò)程中應(yīng)至少設(shè)置一個(gè)陰性和陽(yáng)性對(duì)照，必要時(shí)增加空白對(duì)照。測(cè)序過(guò)程中數(shù)據(jù)Q30（用于衡量高通量測(cè)序中堿基準(zhǔn)確度的指標(biāo)，測(cè)序數(shù)據(jù)中堿基識(shí)別質(zhì)量值為30，表示其堿基識(shí)別準(zhǔn)確率為99.9%）應(yīng)≧80%。宏基因組測(cè)序提取的核酸中DNA的A260/A280值應(yīng)>1.8，RNA的A260/A280值應(yīng)≧2.0。背景核酸模型應(yīng)每個(gè)月更新1次。分子生物學(xué)應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)（Real-timePCR）反應(yīng)體系配制（PCR反應(yīng)液、酶、引物、探針及模板）及反應(yīng)程序設(shè)置（反應(yīng)溫度、循環(huán)數(shù)及熒光通道）應(yīng)參照相應(yīng)病毒核酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)。陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、內(nèi)參（如有）結(jié)果成立時(shí)，進(jìn)行結(jié)果判斷。陰性顯示無(wú)Ct值、無(wú)S形擴(kuò)增曲線，陽(yáng)性顯示Ct值小于或等于病毒核酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)規(guī)定值，且有S形擴(kuò)增曲線。等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)將核酸模板（RNA病毒先進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA鏈）或標(biāo)本上清、引物、DNA合成酶、基質(zhì)等共同置于商品化試劑盒指定溫度下，經(jīng)一個(gè)步驟即可完成。當(dāng)陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果成立時(shí)，應(yīng)使用以下方法進(jìn)行結(jié)果判定：濁度檢測(cè)：肉眼觀察反應(yīng)管內(nèi)出現(xiàn)白色渾濁判定為陽(yáng)性，未渾濁判為陰性；熒光檢測(cè)：加入熒光指示劑后，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)判定結(jié)果。數(shù)字PCR技術(shù)根據(jù)PCR儀器和試劑的要求制備反應(yīng)體系，將體系分配到微小分區(qū)或微滴中并封蓋，進(jìn)行PCR反應(yīng)。使用熒光染料或探針監(jiān)測(cè)目標(biāo)核酸的擴(kuò)增，配套軟件統(tǒng)計(jì)分析各反應(yīng)中的陽(yáng)性液滴數(shù)。當(dāng)陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、內(nèi)參（如有）結(jié)果成立時(shí)，進(jìn)行結(jié)果判斷，確定目標(biāo)核酸及其定量信息，包括標(biāo)本中每個(gè)熒光通道的濃度、精度、誤差，依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行結(jié)果判讀。高通量測(cè)序技術(shù)單一病原體及靶向測(cè)序按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增富集純化，純化后產(chǎn)物進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建、上機(jī)測(cè)序、數(shù)據(jù)分析等步驟。宏基因組測(cè)序?qū)Ψ弦蟮暮怂徇M(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建、上機(jī)測(cè)序、數(shù)據(jù)分析等。具體反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參照相應(yīng)測(cè)序平臺(tái)及試劑盒說(shuō)明書(shū)，根據(jù)應(yīng)急檢測(cè)實(shí)際選擇是否執(zhí)行去宿主操作。單一病原體及靶向測(cè)序完成后，當(dāng)序列覆蓋度、測(cè)序深度滿足質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，可進(jìn)行病毒分型與突變位點(diǎn)分析。宏基因組測(cè)序完成后，應(yīng)先過(guò)濾背景核酸模型，找出標(biāo)本中相對(duì)明確檢出的微生物列表，分析微生物的序列特征及物種檢出情況，最后結(jié)合臨床資料綜合分析判定。免疫學(xué)應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)免疫膠體金技術(shù)檢測(cè)標(biāo)本的類型、上樣體積及操作步驟參照相應(yīng)的試劑盒說(shuō)明書(shū)。實(shí)驗(yàn)完成后按照試劑盒的要求的時(shí)間對(duì)結(jié)果進(jìn)行觀察，當(dāng)檢測(cè)線和質(zhì)控線均為陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，判定對(duì)應(yīng)的檢測(cè)項(xiàng)目陽(yáng)性；當(dāng)質(zhì)控線為陽(yáng)性，檢測(cè)線為陰性結(jié)果時(shí)，判定對(duì)應(yīng)的檢測(cè)項(xiàng)目為陰性；當(dāng)質(zhì)控線為陰性時(shí)，判定結(jié)果為無(wú)效結(jié)果，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定技術(shù)（ELISA）參照試劑盒說(shuō)明書(shū)依次加入抗原包被（如需要）、待檢標(biāo)本上清及對(duì)照、酶標(biāo)記物、底物、終止液，具體流程參照相應(yīng)病毒ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)。以空白對(duì)照調(diào)零，讀取酶標(biāo)儀器上各孔450nm和（或）492nm等波長(zhǎng)的OD值，參照說(shuō)明書(shū)要求設(shè)置參比波長(zhǎng)并計(jì)算陽(yáng)性值，判定結(jié)果?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)參照試劑盒說(shuō)明依次加入磁性顆粒抗原包被、待檢及對(duì)照血清、堿性磷酸酶標(biāo)記的蛋白、底物、堿性磷酸酶催化底物液發(fā)光，具體流程參照相應(yīng)病毒化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)。根據(jù)化學(xué)發(fā)光試劑盒的生物參考區(qū)間判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。