第八章 微生物的遺傳變異和育種4課件

第五節(jié)菌種的衰退、復壯和保藏第八章微生物的遺傳變異和育種4性狀穩(wěn)定的菌種是微生物學工作最重要的基本要求，否則生產或科研都無法正常進行。第八章微生物的遺傳變異和育種4一、菌種的衰退與復壯

（一）衰退

1.定義

衰退（degeneration）是指由于自發(fā)突變的結果，而是某物種原有一系列生物學性狀發(fā)生量變或質變的現(xiàn)象。菌種的衰退是發(fā)生在微生物細胞群中的一個由量變到質變的逐步演化過程。第八章微生物的遺傳變異和育種4菌種原有的典型性狀變得不典型時就稱菌種退化，這種變異也稱負變（minusmutation）。影響微生物菌種穩(wěn)定性的因素：a）變異；b）污染；c）死亡；第八章微生物的遺傳變異和育種4例如，微生物菌落形態(tài)或個體形態(tài)的變化；生長速度緩慢，產孢子量減少；色素產生情況的變化；研究菌種遺傳標記的丟失，生產菌種生產性狀的劣化等。第八章微生物的遺傳變異和育種42.衰退的原因造成菌種退化的主要原因是基因突變。誤區(qū)生產工藝條件控制不當雜菌污染造成生產性能下降飾變第八章微生物的遺傳變異和育種43.衰退的防止（1）選育生產性能穩(wěn)定的菌株作為生產菌株經誘變等處理后的菌種要連續(xù)傳代、分離純化，防止分離回復。（2）控制傳代次數(shù)盡量避免不必要的移種和傳代，并將必要的傳代降低到最低限度，以減少自發(fā)突變的幾率。第八章微生物的遺傳變異和育種4（3）創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件創(chuàng)造一個適合原種的生長條件，就可在一定程度上防止菌種衰退；例如，給予營養(yǎng)缺陷型適當?shù)臓I養(yǎng)必需成分，可降低回復突變頻率。第八章微生物的遺傳變異和育種4（4）利用不同類型的細胞進行接種傳代放線菌和霉菌一般用單核的孢子接種的，菌絲細胞常含有幾個細胞核，甚至是由異核體組成的，用于接種就易出現(xiàn)離異（dissociation）或衰退。例如，構巢曲霉如用分生孢子接種易退化；如用子囊孢子接種則不易退化。第八章微生物的遺傳變異和育種4（5）采用有效的菌種保藏方法菌種保藏的溫度、所用的培養(yǎng)基等可影響自發(fā)突變。第八章微生物的遺傳變異和育種4（二）菌種的復壯（rejuvenation）

1.定義狹義的復壯：是指菌種已發(fā)生衰退后，通過純種分離和測定典型性狀、生產性能等指標，從已衰退的群體中篩選出少數(shù)尚未退化的個體，以達到恢復原菌株固有性狀的相應措施。是一種消極的措施第八章微生物的遺傳變異和育種4廣義的復壯：在菌種的典型特征或生產性狀尚未衰退前，就經常有意識地采取純種分離和生產性狀的測定工作，以期從中選擇到自發(fā)的正變個體。是一項積極的措施第八章微生物的遺傳變異和育種4通過純種分離把退化菌種的細胞群中仍保持原有典型性狀的單細胞分離出來，擴大培養(yǎng)，就可恢復正常。（1）純種分離法（purecultureisolation）1.復壯的方法第八章微生物的遺傳變異和育種4純種分離的方法“菌落純”水平（purecultureincolonylever）“菌株純”水平（purecultureinstrainlever）粗放精細第八章微生物的遺傳變異和育種4第八章微生物的遺傳變異和育種4（2）通過宿主體復壯針對病原菌從典型的病灶部分分離到恢復原始獨立的復壯菌株衰退的病原菌接種相應的昆蟲或動、植物宿主體內活的“選擇性培養(yǎng)基”多次選擇第八章微生物的遺傳變異和育種4（3）淘汰已衰退的個體

S.microflavus“5406”農用抗生菌的分生孢子，采用－10～－30℃的低溫處理5～7天，退化的個體死亡，留下的10％～20％個體是未退化的。第八章微生物的遺傳變異和育種4二、菌種的保藏菌種（culture，stockculture）是一種極其重要和珍貴的生物資源。菌種保藏（preservation，conservation，maintenance）是一項十分重要的基礎性工作。第八章微生物的遺傳變異和育種4在一定時間內使菌種不死、不變、不亂基本要求：用于長期保藏的原始菌種稱為保藏菌種或原種（stochculture）。第八章微生物的遺傳變異和育種4任務：廣泛收集實驗室和生產用菌種、菌株、病毒毒株（有時還包括動、植物的細胞株和微生物質粒等），并將它們妥善保藏，使之不死、不衰、不亂，便于研究、交換和使用。國家設立專門的菌種保藏機構第八章微生物的遺傳變異和育種41.菌種保藏的原理首先，要挑選典型菌種的優(yōu)良純種，最好采用它們的休眠體進行保藏。其次，創(chuàng)造一個使微生物代謝不活潑、生長受抑制的環(huán)境條件。再次，添加保護劑或酸堿中和劑，避免保藏過程中細胞受傷。第八章微生物的遺傳變異和育種42.菌種保藏的方法一種良好的菌種保藏方法保持原菌的優(yōu)良性狀長期穩(wěn)定方法的通用性操作的簡便性設備的普及性第八章微生物的遺傳變異和育種4第八章微生物的遺傳變異和育種4（1）定期移植保藏法操作方法：將菌種接種在斜面、液體或穿刺培養(yǎng)基上，待生長完全后，置普通冰箱4℃保藏，濕度50％～70％以下，棉塞換成不通氣橡皮塞更好。第八章微生物的遺傳變異和育種4優(yōu)點：方便，不受條件限制，各類微生物均可。缺點：時間短、傳代多、易退化。低溫可減緩生長速度，單細胞仍有一定的活動條件，一般4～6個月必須傳代一次。第八章微生物的遺傳變異和育種4（2）液體石蠟法操作方法：生長完全的斜面上覆蓋無菌的液體石蠟，液面高于斜面1cm，普通冰箱保藏。第八章微生物的遺傳變異和育種4加上石蠟可防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，也可隔氧，保藏時間1～2年，除石油發(fā)酵微生物外，各類微生物均可使用。注意：石蠟的純度第八章微生物的遺傳變異和育種4（3）砂土保藏法操作方法：沙和土用酸浸泡去除其中的有機質，洗滌中和，干燥，分裝于安瓶管內，加塞滅菌，把健壯的孢子懸液滴于砂土中攪拌均勻，真空干燥后封口，置于冰箱或干燥器中。第八章微生物的遺傳變異和育種4優(yōu)點：低溫、干燥、無氧、無營養(yǎng)，保藏效果好，時間可達幾年至數(shù)十年。缺點：只適用于產孢子的微生物，不能用于保藏營養(yǎng)細胞。第八章微生物的遺傳變異和育種4（4）冷凍干燥保藏法操作方法：是將液體樣品（含保護劑的菌懸液）在凍結狀態(tài)下升華其中水分，最后達到干燥。培養(yǎng)物用無菌脫脂牛奶—保護劑制成菌懸液，加入安瓶中，冷凍、抽真空、封口。第八章微生物的遺傳變異和育種4第八章微生物的遺傳變異和育種4第八章微生物的遺傳變異和育種4優(yōu)點：低溫、干燥、無氧、有保護劑，可保藏各大類微生物，保藏時間可達幾十年，是目前使用最廣、最有效的保藏方法。一般專業(yè)機構大都使用此法保藏。缺點：不能保藏真菌菌絲。第八章微生物的遺傳變異和育種4（5）液氮保藏法操作方法：液氮溫度可達－196℃。把菌懸液密封于安瓶中，置液氮罐內保藏。優(yōu)點：保藏效果好。缺點：價格昂貴。第八章微生物的遺傳變異和育種4（6）基因工程菌保藏攜帶外源基因的重組質粒通常是不穩(wěn)定的，容易丟失。一般情況，細胞丟失了質粒，生長會加快。基因工程菌的保藏是利用在抗性培養(yǎng)基中只有含重組質粒的細胞才能生長的原理。第八章微生物的遺傳變異和育種4例如，外源DNA插入到質粒pBR322中，重組質粒轉化入E.coli中，使其含有Ampr和Tetr，因此在培養(yǎng)基中加入Ampicillin（氨芐青霉素）和Tetacyclin（四環(huán)素），即可選出含有質粒pBR322的細胞。第八章微生物的遺傳變異和育種4由于微生物的多樣性，不同的微生物往往對不同的保藏方法有不同的適應性，迄今為止尚沒有一種方法能被證明對所有的微生物均適宜。因此，在具體選擇保藏方法時必須對被保藏菌株的特性、保藏物的使用特點及現(xiàn)有條件等進行綜合考慮。對于一些比較重要的微生物菌株，則要盡可能多的采用各種不同的手段進行保藏，以免因某種方法的失敗而導致菌種的喪失。第八章微生物的遺傳變異和育種4第八章微生物的遺傳變異和育種4三、菌種保藏機構

（一）國內1978年7月，中國微生物菌種保藏管理委員會（CCCCM）在北京成立。第八章微生物的遺傳變異和育種4下設六個全國性菌種保藏管理中心1.普通微生物菌種保藏管理中心中科院微生物研究所：細菌、真菌中科院武漢病毒研究所：病毒2.農業(yè)微生物菌種保藏管理中心中國農科院3.工業(yè)微生物菌種保藏管理中心輕工部食品發(fā)酵工業(yè)科學研究所第八章微生物的遺傳變異和育種44.

醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心衛(wèi)生部藥品生物檢定所：細菌中國醫(yī)學科學院皮膚病研究所：真菌中國醫(yī)學科學院病毒研究所：病毒5.

抗生素菌種保藏管理中心國家醫(yī)藥總局四川抗生素研究所：新抗生素菌種華北制藥廠抗生素研究所：生產用抗生素菌種6.

獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心農業(yè)部獸醫(yī)藥品監(jiān)察所第八章微生物的遺傳變異和育種4（二）國外1.國際性機構世界菌種保藏聯(lián)合會（WFCC）2.美國美國典型菌種收藏館（ATCC）農業(yè)研究服務處菌種收藏館（ARS）第八章微生物的遺傳變異和育種4