第十章 高效液相色譜法課件

2025/1/118高效液相色譜法第十章

高效液相色譜法第一節(jié)固定相和流動相

第二節(jié)高效液相色譜儀

第三節(jié)液-固色譜法

第四節(jié)化學鍵合相色譜法

第五節(jié)離子交換色譜法

第六節(jié)尺寸排阻色譜法

第七節(jié)分離方式的選擇及應用

2025/1/118高效液相色譜法色譜法分類示意圖2025/1/118高效液相色譜法概述高效液相色譜法是在氣相色譜和經(jīng)典液相色譜的基礎上70年代初期發(fā)展起來的一種以液體做流動相的新色譜技術?，F(xiàn)代液相色譜和經(jīng)典液相色譜沒有本質的區(qū)別。不同點僅僅是現(xiàn)代液相色譜比經(jīng)典液相色譜有較高的效率和實現(xiàn)了自動化

操作。經(jīng)典的液相色譜法，流動相在常壓下輸送，所用的固定相柱效低，分析周期長。而現(xiàn)代液相色譜法引用了氣相色譜的理論，流動相改為高壓輸送（最高輸送壓力可達4.9

107Pa）；色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜（每米塔板數(shù)可達幾萬或幾十萬）；同時柱后連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進行連續(xù)檢測。因此，高效液相色譜具有分析速度快、分離效能高、自動化等特點。所以人們稱它為高壓、高速、高效或現(xiàn)代液相色譜法。2025/1/118高效液相色譜法一、HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別主要區(qū)別：固定相差別，輸液設備和檢測手段1．經(jīng)典LC：僅做為一種分離手段

柱內(nèi)徑1~3cm，固定相粒徑>100μm且不均勻常壓輸送流動相柱效低（H↑，n↓）分析周期長無法在線檢測2．HPLC：分離和分析

柱內(nèi)徑2~6mm，固定相粒徑<10μm（球形，勻漿裝柱）高壓輸送流動相柱效高（H↓，n↑）分析時間大大縮短可以在線檢測2025/1/118高效液相色譜法二、HPLC與GC差別相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測主要差別：分析對象的差別和流動相的差別1．分析對象

GC：能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點較低的樣品，高沸點、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及高聚物的樣品不可檢測占有機物的20%HPLC：溶解后能制成溶液的樣品，不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及高分子和離子型樣品均可檢測用途廣泛，占有機物的80%2025/1/118高效液相色譜法2．流動相差別GC：流動相為惰性氣體組分與流動相無親合作用力，只與固定相作用HPLC：流動相為液體流動相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、改善分離度增加了因素，對分離起很大作用流動相種類較多，選擇余地廣流動相極性和pH值的選擇也對分離起到重要作用選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動相可以增大分離選擇性3．操作條件差別

GC：加溫操作

HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬?。?025/1/118高效液相色譜法第一節(jié)

固定相和流動相一、固定相二、流動相2025/1/118高效液相色譜法一、固定相

1.高效液相色譜固定相以承受高壓能力來分類，可分為剛性固體和硬膠兩大類。（1）剛性固體以二氧化硅為基質，可承受7.0

108

～

1.0

109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。如果在二氧化硅表面鍵合各種官能團，可擴大應用范圍，它是目前最廣泛使用的一種固定相。（2）硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成?？沙惺軌毫ι舷逓?.5

108Pa。2025/1/118高效液相色譜法

2.固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類。（1）表面多孔型固定相

它的基體是實心玻璃球，在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料，如硅膠、氧化硅、離子交換劑、分子篩、聚酰胺等。這類固定相的多孔層厚度小、孔淺，相對死體積小，出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時能迅速達到平衡，較適合做常規(guī)分析。由于多孔層厚度薄，最大允許量受到限制。2025/1/118高效液相色譜法（2）全多孔型固定相由直徑為10nm的硅膠微粒凝聚而成。這類固定相由于顆粒很細（5～10

m），孔較淺，傳質速率快，易實現(xiàn)高效、高速。特別適合復雜混合物分離及痕量分析。2025/1/118高效液相色譜法

表10-1兩類固定相的性能比較2025/1/118高效液相色譜法二、流動相

對流動相的要求是：1.純度高由于高效液相色譜靈敏度高，對流動相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。2.粘度低若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度過低的溶劑也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它們?nèi)菀自谏V柱或檢測器內(nèi)形成氣泡，影響分離。2025/1/118高效液相色譜法3.化學穩(wěn)定性好

不能選與樣品發(fā)生反應或聚合的溶劑4.

溶劑沸點要高于55℃

低沸點溶劑揮發(fā)度大，容易使流動相濃度或組成發(fā)生變化，也容易產(chǎn)生氣泡5.

溶劑要能完全浸潤固定相溶劑對所測定的組分要有合適的極性，最好選擇樣品的溶劑作流動相，否則發(fā)生溶劑與流動相不相混溶的情況，使分離變壞2025/1/118高效液相色譜法6.溶劑與檢測器匹配

對于紫外吸收檢測器，所選擇的溶劑在檢測器的工作波長下不能有紫外吸收。

對于折光率檢測器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動相，以達到最高靈敏度。2025/1/118高效液相色譜法第二節(jié)

高效液相色譜儀

highperformanceliquidchromatograph一、液相色譜儀器二、流程及主要部件

2025/1/118高效液相色譜法一、液相色譜儀器

highperformanceliquidchromatograph2025/1/118高效液相色譜法液相色譜儀（2）2025/1/118高效液相色譜法液相色譜儀（3）2025/1/118高效液相色譜法液相色譜儀（4）2025/1/118高效液相色譜法二、流程及主要部件

processandmainassemblyofHPLC1.流程2025/1/118高效液相色譜法高效液相色譜儀流程圖1．貯液罐（濾棒，可濾去顆粒狀物質）2．高壓泵（輸液泵）3．進樣裝置4．色譜柱——分離5．檢測器——分析6．廢液出口或組分收集器7．記錄裝置圖10-1高效液相色譜儀結構方塊圖2025/1/118高效液相色譜法2.主要部件高效液相色譜儀由高壓輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)等五大部分組成。分析前，選擇適當?shù)纳V柱和流動相，開泵，沖洗柱子，待柱子達到平衡而且基線平直后，用微量注射器把樣品注入進樣口，流動相把試樣帶入色譜柱進行分離，分離后的組分依次流入檢測器的流通池，最后和洗脫液一起排入流出物收集器。當有樣品組分流過流通池時，檢測器把組分濃度轉變成電信號，經(jīng)過放大，用記錄器記錄下來就得到色譜圖。色譜圖是定性、定量和評價柱效高低的依據(jù)。

2025/1/118高效液相色譜法（1）高壓輸液系統(tǒng)溶劑貯存器高壓泵梯度洗脫裝置壓力表

2025/1/118高效液相色譜法A.溶劑貯存器

溶劑貯存器一般由玻璃、不銹鋼或氟塑料制成，容量為1到2L，用來貯存足夠數(shù)量、符合要求的流動相。

2025/1/118高效液相色譜法B.高壓輸液泵

高壓輸液泵是高效液相色譜儀中關鍵部件之一，其功能是將溶劑貯存器中的流動相以高壓形式連續(xù)不斷地送入液路系統(tǒng)，使樣品在色譜柱中完成分離過程。由于液相色譜儀所用色譜柱徑較細，所填固定相粒度很小，因此，對流動相的阻力較大，為了使流動相能較快地流過色譜柱，就需要高壓泵注入流動相。對泵的要求：輸出壓力高、流量范圍大、流量恒定、無脈動，流量精度和重復性為0.5%左右。此外，還應耐腐蝕，密封性好。

2025/1/118高效液相色譜法續(xù)前高壓輸液泵，按其性質可分為恒壓泵和恒流泵兩大類。恒流泵是能給出恒定流量的泵，其流量與流動相粘度和柱滲透無關。恒壓泵是保持輸出壓力恒定，而流量隨外界阻力變化而變化，如果系統(tǒng)阻力不發(fā)生變化，恒壓泵就能提供恒定的流量。2025/1/118高效液相色譜法C.梯度洗脫裝置

梯度洗脫就是在分離過程中使兩種或兩種以上不同極性的溶劑按一定程序連續(xù)改變它們之間的比例，從而使流動相的強度、極性、pH值或離子強度相應地變化，達到提高分離效果，縮短分析時間的目的。

梯度洗脫的實質是通過不斷地變化流動相的強度，來調整混合樣品中各組分的k值，使所有譜帶都以最佳平均k值通過色譜柱。它在液相色譜中所起的作用相當于氣相色譜中的程序升溫，所不同的是，在梯度洗脫中溶質k值的變化是通過溶質的極性、pH值和離子強度來實現(xiàn)的，而不是借改變溫度（溫度程序）來達到。

2025/1/118高效液相色譜法梯度洗脫裝置外梯度:

利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。內(nèi)梯度:一臺高壓泵,通過比例調節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。2025/1/118高效液相色譜法圖示2025/1/118高效液相色譜法（2）進樣系統(tǒng)

進樣系統(tǒng)包括進樣口、注射器和進樣閥等，它的作用是把分析試樣有效地送入色譜柱上進行分離。2025/1/118高效液相色譜法進樣裝置

流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置，其結構如圖所示：2025/1/118高效液相色譜法（3）分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)包括色譜柱、恒溫器和連接管等部件。色譜柱一般用內(nèi)部拋光的不銹鋼制成。其內(nèi)徑為2~6mm，柱長為10~50cm，柱形多為直形，內(nèi)部充滿微粒固定相。柱溫一般為室溫或接近室溫。2025/1/118高效液相色譜法高效分離柱

柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長5～40cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。2025/1/118高效液相色譜法（4）檢測器檢測器是液相色譜儀的關鍵部件之一。對檢測器的要求是：靈敏度高，重復性好、線性范圍寬、死體積小以及對溫度和流量的變化不敏感等。在液相色譜中，有兩種類型的檢測器，一類是溶質性檢測器，它僅對被分離組分的物理或物理化學特性有響應。屬于此類檢測器的有紫外、熒光、電化學檢測器等；另一類是總體檢測器，它對試樣和洗脫液總的物理和化學性質響應。屬于此類檢測器有示差折光檢測器等。2025/1/118高效液相色譜法a.紫外檢測器

應用最廣，對大部分有機化合物有響應。特點：

靈敏度高；線形范圍高；流通池可做的很?。?mm×10mm，容積8μL）；

對流動相的流速和溫度變化不敏感；波長可選，易于操作；可用于梯度洗脫。

2025/1/118高效液相色譜法b.光電二極管陣列檢測器紫外檢測器的重要進展；光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。2025/1/118高效液相色譜法2025/1/118高效液相色譜法c.示差折光檢測器

（differentialrefractiveindexdetector）除紫外檢測器之外應用最多的檢測器；可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；通用型檢測器（每種物質具有不同的折光指數(shù)）；靈敏度低、對溫度敏感、不能用于梯度洗脫；偏轉式、反射式和干涉型三種；2025/1/118高效液相色譜法d.熒光檢測器

（fluorescencedetector）高靈敏度、高選擇性；對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應；2025/1/118高效液相色譜法第三節(jié)

液-固色譜法一、原理二、固定相三、流動相l(xiāng)iquid-solidadsorptionchromatograph2025/1/118高效液相色譜法液固色譜的固定相是固體吸附劑。吸附劑是一些多孔的固體顆粒物質，位于其表面的原子、離子或分子的性質是多少不同于在內(nèi)部的原子、離子或分子的性質的。表層的鍵因缺乏覆蓋層結構而受到擾動。因此，表層一般處于較高的能級，存在一些分散的具有表面活性的吸附中心

。因此，液固色譜法是根據(jù)各組分在固定相上的吸附能力的差異進行分離，分離前提：K不等或k不等,故也稱為液固吸附色譜。

一、原理2025/1/118高效液相色譜法

吸附劑吸附試樣的能力，主要取決于吸附劑的比表面積和理化性質，試樣的組成和結構以及洗脫液的性質等。組分與吸附劑的性質相似時，易被吸附，呈現(xiàn)高的保留值；當組分分子結構與吸附劑表面活性中心的剛性幾何結構相適應時，易于吸附。從而使吸附色譜成為分離幾何異構體的有效手段；不同的官能團具有不同的吸附能，因此，吸附色譜可按族分離化合物。吸附色譜對同系物沒有選擇性（即對分子量的選擇性?。?，不能用該法分離分子量不同的化合物。2025/1/118高效液相色譜法二、固定相

液固色譜法采用的固體吸附劑按其性質可分為極性和非極性兩種類型。1.極性吸附劑：包括硅膠、氧化鋁、氧化鎂、硅酸鎂、分子篩及聚酰胺等。特點：峰易拖尾;適用：分離極性化合物極性吸附劑可進一步分為酸性吸附劑和堿性吸附劑。酸性吸附劑包括硅膠和硅酸鎂等，堿性吸附劑有氧化鋁、氧化鎂和聚酰胺等。酸性吸附劑適于分離堿，如脂肪胺和芳香胺。堿性吸附劑則適于分離酸性溶質，如酚、羧和吡咯衍生物等。2025/1/118高效液相色譜法2.非極性吸附劑：

最常見的是活性炭。

各種吸附劑中，最常用的吸附劑是硅膠，其次是氧化鋁。特點：柱選擇性好，峰形好，柱效低適用：分離弱極性化合物在現(xiàn)代液相色譜中，硅膠不僅作為液固吸附色譜固定相，還可作為液液分配色譜的載體和鍵合相色譜填料的基體。2025/1/118高效液相色譜法三、流動相液-固色譜的流動相必須符合下列要求：

1.能溶解樣品，但不能與樣品發(fā)生反應。

2.與固定相不互溶，也不發(fā)生不可逆反應。

3.粘度要盡可能小，這樣才能有較高的滲透性和柱效。

4.應與所用檢測器相匹配。例如利用紫外檢測器時，溶劑要不吸收紫外光。

5.容易精制、純化、毒性小，不易著火、價格盡量便宜等。在液-固色譜中，選擇流動相的基本原則是極性大的試樣用極性較強的流動相，極性小的則用低極性流動相。2025/1/118高效液相色譜法流動相組成：底劑（烷烴）+有機極性調節(jié)劑

例：正己烷或庚烷+氯仿---影響k的因素：與固定相性質和流動相性質有關溶質分子極性↑，洗脫能力↓，k↑，tR↑

溶劑系統(tǒng)極性↑，洗脫能力↑，k↓，tR↓注：調節(jié)溶劑極性，可以控制組分的保留時間出柱順序：強極性組分后出柱，弱極性組分先出柱硅膠吸水量↑，LSC→LLC硅膠含水量較小吸附色譜硅膠極性較大硅膠含水量>17%分配色譜硅膠失活→載體吸附的水→固定液2025/1/118高效液相色譜法第四節(jié)

化學鍵合相色譜法一、概述二、化學鍵合相三、反相鍵合相色譜法四、正相鍵合相色譜法2025/1/118高效液相色譜法一、概述

將固定液機械地涂漬在擔體上組成固定相。盡管選用與固定液不互溶的溶劑作流動相，但在色譜過程中固定液仍會有微量溶解。以及流動相經(jīng)過色譜柱的機械沖擊，固定相會不斷流失，即使將流動相預先用固定相液體飽和或在色譜柱前加一個前置柱，使流動相先通過前置柱，再進入色譜柱，但仍難以完全避免固定液的流失。

2025/1/118高效液相色譜法續(xù)前70年代初發(fā)展了一種新型的固定相—化學鍵合固定相。這種固定相是通過化學反應把各種不同的有機基團鍵合到硅膠（載體）表面的游離羥基上，代替機械涂漬的液體固定相。這不僅避免了液體固定相流失的困擾，還大大改善了固定相的功能，提高了分離的選擇性，化學鍵合色譜適用于分離幾乎所有類型的化合物。2025/1/118高效液相色譜法

根據(jù)鍵合相與流動相之間相對極性的強弱，可將鍵合相色譜分為極性鍵合相色譜和非極性鍵合相色譜。在極性鍵合相色譜中，由于流動相的極性比固定相極性要小，所以極性鍵合相色譜屬于正相色譜。弱極性鍵合相既可作為正相色譜，也可作為反相色譜。但通常所說的反相色譜系指非極性鍵合色譜。反相色譜在現(xiàn)代液相色譜中應用最為廣泛。2025/1/118高效液相色譜法二、化學鍵合相化學鍵合固定相一般都采用硅膠（薄殼型或全多孔微粒型）為基體。在鍵合反應之前，要對硅膠進行酸洗、中和、干燥活化等處理，然后再使硅膠表面上的硅羥基與各種有機物或有機硅化合物起反應，制備化學鍵合固定相。2025/1/118高效液相色譜法鍵合相可分為四種鍵型：A硅酸酯型（=Si-O-C=）鍵合相

將醇與硅膠表面的羥基進行酯化反應，在硅膠表面形成（=Si-O-C=）鍵合相。反應生成單分子層鍵合相。一般用極性小的溶劑洗脫，分離極性化合物。B硅氮型（=Si-N=）鍵合相

如果用SOCl2將硅膠表面的羥基先轉化成鹵素（氯化），再與各種有機胺反應，可以得到各種不同極性基因的鍵合相?？捎梅菢O性或強極性的溶劑作為流動相。2025/1/118高效液相色譜法C硅碳型（=Si-C=）鍵合相將硅膠表面氯化后，使Si-Cl鍵轉化為Si-C鍵。在這類固定相中，有機基團直接鍵合在硅膠表面上。D硅氧烷型（=Si-O-Si-C=）鍵合相

將硅膠與有機氯硅烷或烷氧基硅烷反應制備。這類鍵合相具有相當?shù)哪蜔嵝院突瘜W穩(wěn)定性，是目前應用最為廣泛的鍵合相。2025/1/118高效液相色譜法三、反相鍵合相色譜法

在反相色譜中，一般采用非極性鍵合固定相，如硅膠-C18H37（簡稱ODS或C18）硅膠-苯基等，用強極性的溶劑為流動相，如甲醇/水，乙腈/水，水和無機鹽的緩沖液等。目前，對于反相色譜的保留機制還沒有一致的看法，大致有兩種觀點：一種認為屬于分配色譜，另一種認為屬于吸附色譜。在反相鍵合相色譜中，極性大的組分先流出，極性小的組分后流出。分配色譜的作用機制是假設混合溶劑（水+有機溶劑）中極性弱的有機溶劑吸附于非極性烷基配合基表面，組分分子在流動相中與被非極性烷基配合基所吸附的液相中進行分配。2025/1/118高效液相色譜法吸附色譜的作用機制是把非極性的烷基鍵合相，看作是在硅膠表面上覆蓋了一層鍵合的十八烷基的“分子毛”，這種“分子毛”有強的疏水特性。當用水與有機溶劑所組成的極性溶劑為流動相來分離有機化合物時，一方面，非極性組分分子或組分分子的非極性部分，由于疏溶劑的作用，將會從水中被“擠”出來，與固定相上的疏水烷基之間產(chǎn)生締合作用。另一方面，被分離物的極性部分受到極性流動相的作用，使它離開固定相，減少保留值，此即解締過程。顯然，這兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行為。一般地，固定相的烷基配合基或分離分子中非極性部分的表面積越大，或者流動相表面張力及介電常數(shù)越大，則締合作用越強，分配比也越大，保留值越大。

2025/1/118高效液相色譜法四、正相鍵合色譜法

在正相色譜中，一般采用極性鍵合固定相，硅膠表面鍵合的是極性的有機基團，鍵合相的名稱由鍵合上去的基團而定。最常用的有氰基（-CN）、氨基（-NH2）、二醇基（DIOL）鍵合相。流動相一般用比鍵合相極性小的非極性或弱極性有機溶劑，如烴類溶劑，或其中加入一定量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙腈等），以調節(jié)流動相的洗脫強度。通常用于分離極性化合物。2025/1/118高效液相色譜法

一般認為正相色譜的分離機制屬于分配色譜。組分的分配比k值，隨其極性的增加而增大，但隨流動相中極性調節(jié)劑的極性增大（或濃度增大）而降低。同時，極性鍵合相的極性越大，組分的保留值越大。該法主要用于分離異構體，極性不同的化合物，特別是用來分離不同類型的化合物。2025/1/118高效液相色譜法化學鍵合色譜具有下列優(yōu)點：

A.適用于分離幾乎所有類型的化合物。一方面通過控制化學鍵合反應，可以把不同的有機基團鍵合到硅膠表面上，從而大大提高了分離的選擇性；另一方面可以通過改變流動相的組成合乎種類來有效地分離非極性、極性和離子型化合物。

B.由于鍵合到載體上的基團不易被剪切而流失，這不僅解決了由于固定液流失所帶來的困擾，還特別適合于梯度洗脫，為復雜體系的分離創(chuàng)造了條件。2025/1/118高效液相色譜法續(xù)前C.鍵合固定相對不太強的酸及各種極性的溶劑都有很好的化學穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。D.固定相柱效高，使用壽命長，分析重現(xiàn)性好。2025/1/118高效液相色譜法1．分離機制：利用組分在兩相中溶解度的差異2．固定相：載體+固定液（物理或機械涂漬法）缺點：系統(tǒng)內(nèi)部壓力大，易流失，不實用

固定液——極性→NLLC

固定液——非極性→RLLC3．正相色譜——固定液極性>流動相極性（NLLC）

極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱適于分離極性組分反相色譜——固定液極性<流動相極性（RLLC）

極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱適于分離非極性組分液液分配色譜法（LLC）2025/1/118高效液相色譜法（一）常規(guī)化學鍵合相利用化學反應將固定液的官能團鍵合在載體表面

1．分離機制：分配+吸附（以LLC為基礎）

2．特點：不易流失熱穩(wěn)定性好化學性能好載樣量大適于梯度洗脫4、化學鍵合固定相2025/1/118高效液相色譜法（二）反相鍵合相固定相1．分離機制：疏溶劑理論正相——流動相與溶質排斥力強，作用時間↑，k↑，組分tR↑

反相——流動相與溶質排斥力弱，作用時間↓，k↓，組分tR↓2．固定相：極性小的烷基鍵合相

C8柱，C18柱（ODS柱——HPLC約80%問題）3．流動相：極性大的甲醇-水或乙腈-水流動相極性>固定相極性底劑+有機調節(jié)劑（極性調節(jié)劑）

例：水+甲醇，乙腈，THF2025/1/118高效液相色譜法4．流動相極性與k的關系：流動相極性↑，洗脫能力↓，k↑，組分tR↑5．出柱順序：極性大的組分先出柱極性小的組分后出柱6．適用：非極性~中等極性組分（HPLC80%問題）（三）正相鍵合相色譜1．分離機制：溶質分子與固定相之間定向作用力、誘導力、或氫鍵作用力2．固定相：極性大的氰基或氨基鍵合相3．流動相：極性?。ㄍ琇SC）底劑+有機極性調節(jié)劑

例：正己烷+氯仿-甲醇，氯仿-乙醇2025/1/118高效液相色譜法4．流動相極性與k的關系：流動相極性↑，洗脫能力↑，組分tR↓，k↓5．出柱順序：結構相近組分，極性小的組分先出柱極性大的組分后出柱6．適用：氰基鍵合相與硅膠的柱選擇性相似（極性稍?。┓蛛x物質也相似氨基鍵合相與硅膠性質差別大，堿性分析極性大物質、糖類等2025/1/118高效液相色譜法第五節(jié)

離子交換色譜法一、原理二、固定相三、流動相四、離子色譜法ion-exchange

chromatograph2025/1/118高效液相色譜法

離子交換色譜法是利用離子交換原理和液相色譜技術的結合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法。凡在溶液中能夠電離的物質，通常都可用離子交換色譜法進行分離。它不僅適用無機離子混合物的分離，亦可用于有機物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質等生物大分子，因此應用范圍較廣。

2025/1/118高效液相色譜法一、原理

離子交換色譜法是利用不同待測離子對固定相親和力的差別來實現(xiàn)分離的。其固定相采用離子交換樹脂，樹脂上分布有固定的帶電荷基團和可游離的平衡離子。當待分析物質電離后產(chǎn)生的離子可與樹脂上可游離的平衡離子進行可逆交換，其交換反應通式如下：

陽離子交換：陰離子交換：

一般形式：R一A＋B＝R－B＋A2025/1/118高效液相色譜法對于陽離子交換樹脂，一價離子的選擇性順序為：

Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li+二價離子的順序為：

Ba2+＞Pb2+＞Sr2+＞Ca2+＞Cd2+＞Cu2+，Zn2+＞Mg2+對于陰離子交換樹指，各陰離子的選擇性順序為：

ClO4-＞I-＞HS04-＞SCN-＞NO2-＞Br-＞CN-＞Cl-＞BrO3-＞OH-

＞HCO3-＞H2P04-＞IO3-＞CH3COO－＞F－2025/1/118高效液相色譜法二、固定相

作為固定相的離子交換劑，其基質大致有三大類：合成樹脂（聚苯乙烯）、纖維素和硅膠。而離子交換劑又有陽離子和陰離子之分。再根據(jù)官能基的離解度大小還有強弱之分（見下表）表10-2離子交換劑上的官能基2025/1/118高效液相色譜法

常用的離子交換劑固定相大致可分以下幾種：1.多孔型離子交換樹脂它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交聯(lián)聚合物，直徑約為5～20μm，有微孔型和大孔型之分2.薄膜型離子交換樹脂

它是在直徑約為30μm的固體情性核上，凝聚1～2μm厚的樹脂層。3.表面多孔型離子交換樹脂

它是在固體情性核上，覆蓋一層微球硅膠，再在上面涂一層很薄的離子交換樹脂。2025/1/118高效液相色譜法4.離子交換鍵合固定相它是用化學反應將離子交換基團鍵合到惰性載體表面。它也分為兩種類型。一種是鍵合薄殼型，其載體是薄殼玻珠。另一種是鍵合微粒載體型，它的載體是多孔微粒硅膠。后者是一種優(yōu)良的離子交換固定相，它的優(yōu)點是機械性能穩(wěn)定，可使用小粒度固定相和高柱壓來實現(xiàn)快速分離。2025/1/118高效液相色譜法三、流動相離子交換色譜法所用流動相大都是一定pH和鹽濃度（或離子強度）的緩沖溶液。通過改變流動相中鹽離子的種類、濃度和pH值可控制k值，改變選擇性。如果增加鹽離子的濃度，則可降低樣品離子的競爭吸附能力，從而降低其在固定相上的保留值。關于pH值的影響，要視不同情況而定。例如，分離有機酸和有機堿時，這些酸堿的離解程度可通過改變流動相的pH值來控制。增大pH值會使酸的電離度增加，使堿的電離度減少；降低pH值，其結果相反。但無論屬于哪種情況，只要電離度增大，就會使樣品的保留值增大。

2025/1/118高效液相色譜法四、離子色譜法

離子色譜法是由離子交換色譜法派生出來的一種分離方法。離子交換色譜法在無機離子的分析和應用受到限制。例如，對于那些不能采用紫外檢測器的被測離子，如采用電導檢測器，由于被測離子的電導信號被強電解質流動相的高背景電導信號淹沒而無法檢測。為了解決這一問題，1975年Small等人提出一種能同時測定多種無機和有機離子的新技術：2025/1/118高效液相色譜法續(xù)前他們在離子交換分離柱后加一根抑制柱，抑制柱中裝填與分離柱電荷相反的離子交換樹脂。通過分離柱后的樣品再經(jīng)過抑制柱，使具有高背景電導的流動相轉變成低背景電導的流動相，從而用電導檢測器可直接檢測各種離子的含量。這種色譜技術稱為離子色譜。若樣品為陽離子，用無機酸作流動相，抑制柱為高容量的強堿性陰離子交換劑。當試樣經(jīng)陽離子交換劑的分離柱后，隨流動相進入抑制柱，在抑制柱中發(fā)生兩個重要反應：2025/1/118高效液相色譜法R+－OH＋H+Cl-→R+－Cl十H2OR+一OH-＋M+Cl-→M+OH－＋R+－Cl-

由反應可見：經(jīng)抑制柱后，一方面將大量酸轉變?yōu)殡妼Ш苄〉乃?，消除了流動相本底電導的影響。同時，又將樣品陽離子M+轉變成相應的堿，由于OH-離子的淌度為Cl-離子的2.6倍，提高了所測陽離子電導的檢測靈敏度。對于陰離子樣品也有相似的作用機理。

2025/1/118高效液相色譜法續(xù)前在分離柱后加一個抑制柱的離子色譜亦稱為抑制型離子色譜或稱雙柱離子色譜。由于抑制柱要定期再生，而且譜帶在通過抑制柱后會加寬，降低了分離度。后來，F(xiàn)rits等人提出采用非抑制柱的離子色譜體系，而采用了電導率極低的溶液，例如1×10-4～5×10-4mol·L-3苯甲酸鹽或鄰苯二甲酸鹽的稀溶液作流動相，稱為非抑制型離子色譜或單柱離子色譜。2025/1/118高效液相色譜法1.離子色譜法原理離子色譜原理，與傳統(tǒng)離子交換的不同點：采用交換容量非常低的特制離子交換樹脂為固定相；細顆粒柱填料，高柱效；采用高壓輸液泵；低濃度淋洗液或本底電導抑制（在分離柱后，采用抑制柱來消除淋洗液的高本底電導）；可采用電導檢測器，快速分離分析微量無機離子混合物；各種抑制裝置及無抑制方法的出現(xiàn)，發(fā)展迅速。2025/1/118高效液相色譜法2.離子色譜具有以下優(yōu)點（1）分析速度快

可在數(shù)分鐘內(nèi)完成一個試樣的分析；（2）分離能力高

在適宜的條件下，可使常見的各種陰離子混合物分離；例：使用雙柱法，在十幾分鐘內(nèi)，可使七種陰離子完全分離。（3）分離混合陰離子的最有效方法（4）耐腐蝕，儀器流路采用全塑件，玻璃柱2025/1/118高效液相色譜法3.離子色譜法裝置：2025/1/118高效液相色譜法第六節(jié)

尺寸排阻色譜法一、原理二、固定相三、流動相size-exclusionchromatograph2025/1/118高效液相色譜法

尺寸排阻色譜法又稱凝膠色譜法，主要用于較大分子的分離。與其他液相色譜方法原理不同，它不具有吸附、分配和離子交換作用機理，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實現(xiàn)分離的。

2025/1/118高效液相色譜法尺寸排阻色譜具有其他液相色譜所沒有的特點：

（1）保留時間是分子尺寸的函數(shù)，有可能提供分子結構的某些信息。(2)保留時間短，譜峰窄，易檢測，可采用靈敏度較低的檢測器。（3）固定相與分子間作用力極弱，趨于零。由于柱子不能很強保留分子，因此柱壽命長。（4）不能分辨分子大小相近的化合物，相對分子質量差別必須大于10％才能得以分離。2025/1/118高效液相色譜法一、原理

尺寸排阻色譜是按分子大小順序進行分離的一種色譜方法。其固定相為化學惰性多孔物質——凝膠，它類似于分子篩，但孔徑比分子篩大。凝膠內(nèi)具有一定大小的孔穴，體積大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早地被淋洗出來；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱。這樣，樣品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。其滲透過程模型見圖20-7。2025/1/118高效液相色譜法2025/1/118高效液相色譜法

二、固定相

排阻色譜固定相種類很多，一般可分為軟性、半剛性和剛性凝膠三類。所謂凝膠，指含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于彈性的物質，它是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結構的多聚體。

1.軟性凝膠如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠都具有較小的交聯(lián)結構，其微孔能吸入大量的溶劑，并能溶脹到它們干體的許多倍。它們適用以水溶性溶劑作流動相，一般用于小分子質量物質的分析，不適宜用在高效液相色譜中。

2025/1/118高效液相色譜法2.半剛性凝膠如高交聯(lián)度的聚苯乙烯（Styragel）