實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用指南(WST-230-2024)

實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)

臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用指南

（WST230—2024）1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)在臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用中的樣本采集和處理、方法、污染預(yù)防和控制、質(zhì)量管理、結(jié)果判讀和報(bào)告、實(shí)驗(yàn)室生物安全、臨床適用范圍等要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于全國各級(jí)各類醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)及醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室開展核酸擴(kuò)增基因定性及定量檢測。本標(biāo)準(zhǔn)不適用于基于核酸雜交、核酸恒溫?cái)U(kuò)增、基因測序等技術(shù)所開展的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本標(biāo)準(zhǔn)必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T37874核酸提取純化方法評(píng)價(jià)通則GB/T40974核酸樣本質(zhì)量評(píng)價(jià)方法JJF1874（自動(dòng)）核酸提取儀校準(zhǔn)規(guī)范JJF1527聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)規(guī)范2規(guī)范性引用文件WS233病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全通用準(zhǔn)則WS/T348尿液標(biāo)本的采集與處理WS/T414室間質(zhì)量評(píng)價(jià)不合格原因分析WS/T640臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)本的采集和轉(zhuǎn)運(yùn)WS/T661靜脈血液標(biāo)本采集指南3術(shù)語和定義3.1聚合酶鏈反應(yīng)polymerasechainreaction;PCR一種利用人工合成的寡核苷酸作為引物介導(dǎo)的DNA目標(biāo)序列特異性酶促擴(kuò)增技術(shù)。當(dāng)存在模板、底物、引物和耐熱DNA聚合酶時(shí)，通過調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度引導(dǎo)多次“變性-退火-延伸”反應(yīng)循環(huán)，可令痕量DNA模板擴(kuò)增數(shù)百萬倍。3.2實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)real-timefluorescencepolymerasechainreaction;real-timePCR在PCR反應(yīng)體系中引入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，通過連續(xù)監(jiān)測繪制反應(yīng)動(dòng)力曲線，從而對(duì)樣本中被擴(kuò)增模板DNA的初始含量進(jìn)行計(jì)算。該技術(shù)包含定性和定量檢測，常以qPCR（quantitativepolymerasechainreaction）代表定量檢測。3術(shù)語和定義3術(shù)語和定義3.3反轉(zhuǎn)錄reversetranscription;RT以RNA單鏈為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶催化下合成互補(bǔ)DNA（即cDNA）的過程。3.4模板template復(fù)制或轉(zhuǎn)錄、反轉(zhuǎn)錄過程中用來產(chǎn)生互補(bǔ)鏈的DNA或RNA核苷酸序列。3.5目標(biāo)序列targetsequence擬通過PCR技術(shù)進(jìn)行定性或定量檢測的特定核酸序列區(qū)域。3術(shù)語和定義3.6引物primer具有特定序列的人工合成寡核苷酸片段，可與目標(biāo)序列區(qū)域上下游互補(bǔ)，從而形成穩(wěn)定的氫鍵連接，促進(jìn)DNA聚合酶的結(jié)合和DNA鏈的延伸。3.7熒光探針fluorescentprobe根據(jù)特定基因序列設(shè)計(jì)的標(biāo)記有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的人工合成寡核苷酸片段，與互補(bǔ)序列退火雜交后，通過PCR擴(kuò)增酶促反應(yīng)釋放熒光信號(hào)，用于檢測樣本中是否含有特定基因序列。3.8變性denaturationPCR反應(yīng)體系中，利用高溫條件破壞核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)中的氫鍵，使DNA與RNA均從復(fù)雜高級(jí)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榫€性單鏈核苷酸的過程。3術(shù)語和定義3.9退火annealingPCR反應(yīng)體系中，需通過降低反應(yīng)體系溫度，使兩條線性單鏈核苷酸通過互補(bǔ)堿基間的氫鍵形成局部雙鏈的過程。3.10延伸extensionPCR反應(yīng)體系中，引物與模板發(fā)生退火后，在耐熱DNA聚合酶作用下，根據(jù)模板DNA的堿基順序，以單個(gè)核苷酸為原料，自引物5’端向3’端逐個(gè)添加核苷酸合成兩條互補(bǔ)鏈的過程。3.11DNA聚合酶DNApolymerase以DNA單鏈為模板、dNTP為原料，催化脫氧核苷酸加到引物或DNA鏈的3′-OH端，合成互補(bǔ)DNA新鏈所需的酶。3術(shù)語和定義3.12反轉(zhuǎn)錄酶reversetranscriptase以RNA為模板指導(dǎo)dNTPs合成互補(bǔ)DNA的聚合酶。3.13插入insertionDNA或RNA的一種突變形式，在原有核苷酸序列中插入了一個(gè)或多個(gè)額外核苷酸。3.14缺失deletionDNA或RNA的一種突變形式，在原有核苷酸序列中丟失了一個(gè)或多個(gè)原有核苷酸。3.15抑制物inhibitor/干擾物interferentPCR檢測反應(yīng)體系中抑制或干擾PCR反應(yīng)進(jìn)行的物質(zhì)，可導(dǎo)致PCR產(chǎn)物產(chǎn)量減少或非特異性產(chǎn)物增多。3術(shù)語和定義3.16污染contamination由于樣本交叉污染或試劑、標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、擴(kuò)增產(chǎn)物污染等原因，導(dǎo)致PCR擴(kuò)增體系中混入來自待檢樣本以外的模板，使PCR檢測出現(xiàn)假陽性結(jié)果的情況。3.17循環(huán)閾值cyclethreshold（Ct）value實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號(hào)強(qiáng)度由本底水平達(dá)到所設(shè)定熒光閾值限時(shí)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，即循環(huán)閾值，其數(shù)值大小與模板核酸片段的起始拷貝數(shù)成反比。3.18轉(zhuǎn)運(yùn)transport樣本由采樣地點(diǎn)運(yùn)送到檢測地點(diǎn)的過程，分為內(nèi)部轉(zhuǎn)運(yùn)（例如檢測機(jī)構(gòu)內(nèi)部使用人工或氣動(dòng)傳輸裝置等進(jìn)行送樣）和外部轉(zhuǎn)運(yùn)（例如檢測機(jī)構(gòu)間使用汽車、火車、飛機(jī)等交通工具進(jìn)行送樣）。4縮略語cDNA互補(bǔ)DNA（complementaryDNA）cfDNA游離DNA（cellfreeDNA）Ct循環(huán)閾值（cyclethresholdvalue）ctDNA循環(huán)腫瘤DNA（circulatingtumorDNA）DNA脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）DNase脫氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease）dNTP脫氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）4縮略語dsDNA雙鏈DNA（double-strandedDNA）EDTA乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid）FFPE福爾馬林固定石蠟包埋（formalin-fixedparaffin-embedded）miRNA微小RNA（microRNA）mRNA信使RNA（messagerRNA）PCR聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction）RNA核糖核酸（ribonucleicacid）4縮略語RNase核糖核酸酶（ribonuclease）RT-PCR反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reversetranscriptionpolymerasechainreaction）SOP標(biāo)準(zhǔn)操作程序（standardoperatingprocedure）ssDNA單鏈DNA（single-strandedDNA）real-timePCR實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)（real-timefluorescencepolymerasechainreaction）rRNA核糖體RNA（ribosomalRNA）Tm熔解溫度（meltingtemperature）UDG尿嘧啶-DNA糖基水解酶(uracil-DNAglycosy5樣本采集和處理應(yīng)正確進(jìn)行樣本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)、處理和保存，發(fā)生在分析前階段的操作不當(dāng)可能會(huì)破壞樣本完整性、導(dǎo)致核酸降解，引入污染或干擾物，最終影響目標(biāo)序列定性或定量檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)就各環(huán)節(jié)制定詳細(xì)的技術(shù)要求，并向樣本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)、接收、檢測人員分別提供相應(yīng)培訓(xùn)。5.1總體要求5樣本采集和處理5.2.1總體要求5.2.1.1實(shí)驗(yàn)室在開展實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)服務(wù)時(shí)，除常規(guī)遵循體外診斷樣本采集要求外，還可參照WS/T661、WS/T348、WS/T640進(jìn)行。應(yīng)結(jié)合不同檢測項(xiàng)目對(duì)樣本的要求，并參考所使用試劑及耗材的說明，制定詳細(xì)的樣本采集程序，包括采樣時(shí)效、采樣部位、樣本類型、采樣裝置與采集容器、采集方法、采樣量、質(zhì)量評(píng)價(jià)注意事項(xiàng)，并對(duì)采樣人員提供相應(yīng)培訓(xùn)與指導(dǎo)。5.2樣本采集5樣本采集和處理5.2.1.2采樣人員在采集樣本前應(yīng)核對(duì)受檢者身份、采樣部位、樣本類型、采樣裝置與采集容器。采集完成的樣本應(yīng)予唯一性標(biāo)識(shí)。5.2.1.3如需受檢者自行留取樣本（例如痰液、尿液），應(yīng)指導(dǎo)其如何正確留取并送檢，避免因操作不當(dāng)造成樣本質(zhì)量不合格、檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。5.2樣本采集5樣本采集和處理5.2.2樣本類型5.2.2.1采樣時(shí)應(yīng)參考檢測項(xiàng)目要求、疾病特性、病原微生物感染部位或感染細(xì)胞類型等因素，選擇采樣部位與樣本類型，以確保所采集樣本中含有檢測目標(biāo)序列。5.2樣本采集5樣本采集和處理5.2.2.2實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)可檢測的臨床樣本類型包括組織（新鮮組織、石蠟切片組織）、細(xì)胞及其培養(yǎng)產(chǎn)物、EDTA或枸櫞酸抗凝全血、干血斑、血清、血漿、外周血單個(gè)核細(xì)胞、骨髓、其他體液（例如腦脊液、漿膜腔積液、尿液、房水等）、產(chǎn)前診斷樣本（絨毛膜、絨毛膜培養(yǎng)細(xì)胞、羊水、羊水培養(yǎng)細(xì)胞等）、拭子（采集分泌物、脫落細(xì)胞、微生物等）、分泌物（痰液、膿液、唾液等）、體腔與體表沖洗液（含脫落細(xì)胞、cfDNA）、糞便、含微生物的臨床樣本或微生物培養(yǎng)樣本，等。5.2樣本采集5樣本采集和處理5.2.3采樣時(shí)效5.2.3.1應(yīng)結(jié)合不同檢測目的與疾病特點(diǎn)，明確樣本采集的時(shí)效性，避免因在疾病發(fā)生發(fā)展過程中樣本采集過早或過遲而導(dǎo)致假陰性結(jié)果。感染性疾病可考慮在病程不同階段連續(xù)采樣送檢。5.2.3.2手術(shù)、輸血、藥物治療等醫(yī)療行為可影響實(shí)時(shí)熒光PCR檢測結(jié)果，采樣前應(yīng)明確患者有無接受上述診療行為，如有宜建議推遲采樣或在報(bào)告中備注相關(guān)情況。5.2.3.3采樣完成后應(yīng)標(biāo)明或記錄具體采樣時(shí)間以供回溯。5.2樣本采集5樣本采集和處理5.2.4防污染操作5.2.4.1采樣過程中應(yīng)注意避免外源性核酸污染。5.2.4.2病原微生物檢測采樣時(shí)遵守?zé)o菌操作，避免樣本被環(huán)境微生物和定植微生物污染。5.2樣本采集5樣本采集和處理5.2.5采樣裝置和采集容器5.2.5.1應(yīng)為無菌、無DNase/RNase、一次性。所用材質(zhì)與所含添加物不可抑制或干擾PCR檢測過程。5.2.5.2全血和骨髓樣本抗凝首選EDTA與枸櫞酸鹽，不可使用肝素。如同時(shí)采集多管樣本，應(yīng)根據(jù)采集容器添加物類型及對(duì)PCR反應(yīng)有無影響制定填裝順序。其中，真空采血管采集順序可參照WS/T661執(zhí)行。5.2樣本采集5樣本采集和處理5.3.1應(yīng)結(jié)合不同樣本類型與檢測目標(biāo)核酸特性，參考試劑盒說明書要求，制定樣本轉(zhuǎn)運(yùn)與保存過程中的時(shí)間、溫濕度條件及生物安全要求。5.3.2樣本經(jīng)采集后，應(yīng)盡可能減少運(yùn)送環(huán)節(jié)、縮短轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)運(yùn)達(dá)實(shí)驗(yàn)室。5.3樣本轉(zhuǎn)運(yùn)5樣本采集和處理5.4.1應(yīng)結(jié)合不同檢測項(xiàng)目制定各自詳盡的樣本接收/拒收標(biāo)準(zhǔn)及不合格樣本退收流程。5.4.2對(duì)經(jīng)評(píng)估質(zhì)量合格的樣本應(yīng)收盡收。樣本質(zhì)量評(píng)估應(yīng)充分考慮樣本運(yùn)送時(shí)間和條件，不同類型樣本的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)包含以下方面：a)全血樣本：EDTA或枸櫞酸抗凝、樣本量適宜、專用容器、無凝血或溶血；5.4樣本接收5樣本采集和處理b)血漿（清）樣本：樣本量適宜、專用容器；c)其他體液：樣本量適宜、專用容器、無污染物；d)拭子：專用拭子、保存液和容器；e)組織：樣本量適宜、專用容器、保存液。5.4.3已接收樣本應(yīng)在規(guī)定時(shí)間內(nèi)錄入實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)，做好接收登記，便于臨床實(shí)時(shí)查詢和追蹤樣本狀態(tài)。5.4樣本接收5樣本采集和處理5.4.4樣本拒收當(dāng)樣本經(jīng)評(píng)估不符合接收質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，例如：標(biāo)記信息錯(cuò)誤或不足、樣本類型和申請(qǐng)檢測項(xiàng)目不符、抗凝方式不當(dāng)、采集容器不符合專業(yè)規(guī)范、破損或嚴(yán)重污染、樣本處理或轉(zhuǎn)運(yùn)不當(dāng)、樣本量不滿足檢測最低要求，等。實(shí)驗(yàn)室可拒收樣本并做好相應(yīng)記錄，同時(shí)盡快通知樣本采集部門，向其解釋拒收原因并建議重新采集合格樣本。5.4樣本接收5樣本采集和處理5.4.5讓步檢測標(biāo)準(zhǔn)5.4.5.1特殊情況下如必須進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)室就樣本可搶救程度及檢測可行性進(jìn)行評(píng)估后，應(yīng)就樣本可能存在的檢測影響因素充分告知臨床醫(yī)師，經(jīng)溝通許可后行讓步檢驗(yàn)并將具體情況詳細(xì)記錄在案，同時(shí)在檢測報(bào)告中備注樣本特殊情況。5.4.5.2明確存在以下情況的樣本不宜進(jìn)一步行PCR檢測：肝素抗凝血樣、無標(biāo)識(shí)/標(biāo)記錯(cuò)誤的樣本。溶血及經(jīng)凍融的全血樣本不宜用于cfDNA檢測。5.4樣本接收5樣本采集和處理5.5.1總體要求實(shí)施實(shí)時(shí)熒光PCR檢測前，可采用經(jīng)有效驗(yàn)證的技術(shù)方法從各類型樣本中提取和純化核酸，制備成擴(kuò)增模板。提取與純化操作可令核酸物質(zhì)釋放、提高目標(biāo)核酸濃度、去除PCR抑制物、提高PCR擴(kuò)增成功率和可重復(fù)性，有利于檢測標(biāo)準(zhǔn)化。5.5樣本處理5樣本采集和處理5.5.2樣本前處理5.5.2.1總體要求應(yīng)根據(jù)樣本類型、目標(biāo)核酸來源、疾病特點(diǎn)、檢測目的，選取適宜的樣本前處理方式。5.5.2.2離心對(duì)樣本中特殊來源或穩(wěn)定性差、含量低、易降解的核酸片段（例如RNA、cfDNA），應(yīng)及時(shí)離心分離相應(yīng)檢測成分。全血樣本可經(jīng)離心后分離血清、血漿、外周血單核細(xì)胞，其他體液樣本可經(jīng)離心后分離上清、沉渣。5.5樣本處理5樣本采集和處理5.5.2.3混勻拭子、導(dǎo)管等樣本可經(jīng)振蕩，使粘附于其表面的細(xì)胞、菌體、病毒洗脫入樣本保存液。5.5.2.4均質(zhì)化當(dāng)細(xì)胞、菌體、病毒被裹挾或黏附在其它物質(zhì)內(nèi)時(shí)，可通過均質(zhì)化使其釋放。例如：痰液樣本宜先消化釋放菌體；糞便樣本宜機(jī)械混勻；組織樣本宜剪碎研磨。5.5樣本處理5樣本采集和處理5.5.2.5濃縮和富集對(duì)檢測目標(biāo)序列含量較低的樣本，應(yīng)通過適宜技術(shù)手段進(jìn)行分離以實(shí)現(xiàn)濃縮和富集，提高檢測靈敏度。例如：糞便、尿液、腦脊液和其他體液樣本中的細(xì)胞可經(jīng)離心分離；血液及其他體液樣本中的特定細(xì)胞亞群可經(jīng)流式細(xì)胞熒光分選、磁珠捕獲等方法分離；組織樣本中的特定類型細(xì)胞可經(jīng)激光捕獲顯微切割獲取。5.5樣本處理5樣本采集和處理5.5.3組織樣本處理5.5.3.1新鮮組織樣本可采用均質(zhì)器打勻、鋼珠打磨、液氮研磨等方法對(duì)樣本進(jìn)行均質(zhì)化，再以蛋白酶K消化處理。5.5.3.2在沒有新鮮或冷凍組織樣本的情況下，可使用中性福爾馬林固定石蠟包埋組（formalin-fixedparaffin-embedded，F(xiàn)FPE）樣本。FFPE組織切片用于核酸提取前，應(yīng)經(jīng)過脫蠟、乙醇漂洗、風(fēng)干、蛋白酶K消化處理。5.5樣本處理5樣本采集和處理5.5.4核酸提取與純化5.5.4.1總體要求應(yīng)根據(jù)樣本類型、目標(biāo)核酸類型（DNA/RNA）選擇核酸提取與純化方法。首要原則為確保核酸結(jié)構(gòu)完整度，其次為去除其他干擾物，采取相應(yīng)處理方法保證核酸的提取質(zhì)量和產(chǎn)量，以確保滿足下游檢測要求。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)針對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測項(xiàng)目要求制定并遵照核酸提取與純化SOP。采用商品化核酸提取試劑盒前，應(yīng)對(duì)其核酸提取效率進(jìn)行評(píng)估，包括核酸純度、提取產(chǎn)率、完整性。5.5樣本處理5樣本采集和處理5.5.4.2DNA提取應(yīng)根據(jù)組織、血液、拭子、尿液、糞便等不同樣本類型及檢測目的選擇適宜提取方法。目前臨床常用磁珠分離純化法，該法高效且易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，適宜在樣本量大的情況下使用。5.5.4.3RNA提取應(yīng)根據(jù)目標(biāo)RNA類型（總RNA、mRNA、miRNA）、下游檢測所需模板純度、處理樣本耗時(shí)和成本、以及RNA完整度要求進(jìn)行選擇。RNA提取過程中應(yīng)做好環(huán)境消毒、操作者自身防護(hù)、器材預(yù)處理，注意避免RNase污染，以免RNA降解。主要方法包括：柱提法和磁珠分離法。5.5樣本處理5樣本采集和處理5.5.5核酸模板的轉(zhuǎn)化5.5.5.1甲基化位點(diǎn)轉(zhuǎn)化甲基化檢測需以亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶保持不變，再利用針對(duì)甲基化和非甲基化序列的引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測。影響轉(zhuǎn)化的主要因素包括亞硫酸氫鹽濃度、反應(yīng)溫度、pH值及反應(yīng)時(shí)間，應(yīng)嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，以保證轉(zhuǎn)化效率。5.5.5.2RNA反轉(zhuǎn)錄RNA需以O(shè)ligo（dT）或隨機(jī)引物經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成為cDNA，再進(jìn)行后續(xù)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測。5.5樣本處理5樣本采集和處理5.5.6核酸模板質(zhì)量評(píng)價(jià)經(jīng)上述樣本處理后獲得的擴(kuò)增核酸模板提取產(chǎn)量、純度和完整度應(yīng)符合后續(xù)檢測要求，以滿足擴(kuò)增有效性和結(jié)果準(zhǔn)確性。具體評(píng)價(jià)指標(biāo)及判斷標(biāo)準(zhǔn)、方法及操作步驟可參考GB/T37874、GB/T40974。如不符合相應(yīng)要求，應(yīng)分析原因后重新采集樣本，或?qū)颖局匦逻M(jìn)行抽提。5.5樣本處理5樣本采集和處理5.6.1原始樣本的保存5.6.1.1除核酸提取純化所需樣本量外，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)盡力保留和妥善保存殘余樣本，以便追溯和復(fù)檢。5.6.1.2實(shí)驗(yàn)室應(yīng)結(jié)合不同樣本類型與目標(biāo)核酸特性明確原始樣本保存條件與期限，就不同保存條件進(jìn)行驗(yàn)證，并避免樣本反復(fù)凍融以備需要時(shí)復(fù)檢。5.6.1.3為避免RNA表達(dá)水平變化與降解，用于RNA檢測的血液樣本應(yīng)直接抽取到含有RNA穩(wěn)定添加劑的采血管中保存，組織樣本立即放入含有RNA穩(wěn)定劑的保存管中或直接放入液氮中快速冷凍保存。5.6樣本保存5樣本采集和處理5.6.2核酸模板的保存5.6.2.1經(jīng)提取純化后的核酸模板應(yīng)以適當(dāng)條件保存，以盡可能減少核酸降解。5.6.2.2保存容器材質(zhì)應(yīng)避免吸附核酸，或誘導(dǎo)核酸結(jié)構(gòu)變化。保存痕量核酸樣本時(shí)，宜選擇低吸附性材料以防核酸損失。5.6樣本保存5樣本采集和處理5.6.2.3保存體系以及溫度條件應(yīng)根據(jù)核酸模板類型以及保存期限進(jìn)行選擇。擬長期保存可參考：a)DNA：置于Tris-EDTA緩沖液，保存于0℃以下；b)RNA：置于乙醇緩沖液，保存于-70℃以下或液氮；c)cfDNA：置于TE緩沖液，保存于-20℃及以下。5.6.2.4用于保存核酸樣本的制冷設(shè)備不應(yīng)啟用自動(dòng)化霜功能，以免溫度反復(fù)波動(dòng)致核酸降解、樣本變質(zhì)。5.6樣本保存5樣本采集和處理5.6.3保存樣本的取用5.6.3.1檢測后殘余樣本的保存周期應(yīng)參照國家或地方相關(guān)法律法規(guī)，當(dāng)無文件可參照時(shí)，應(yīng)與臨床協(xié)商制定。5.6.3.2對(duì)檢測結(jié)果有疑問、爭議或投訴時(shí)，可取用保存樣本進(jìn)行復(fù)檢并記錄。5.6樣本保存6方法6.1.1總體原則實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增體系包括引物、熒光化學(xué)物質(zhì)（染料或探針）、DNA聚合酶、dNTP、模板、Mg2+及反應(yīng)緩沖液等成分。引物和探針的設(shè)計(jì)是影響該技術(shù)的關(guān)鍵因素，其決定了檢測準(zhǔn)確性和特異性；合適的DNA聚合酶對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的成功至關(guān)重要；dNTP的質(zhì)量與濃度影響擴(kuò)增效率；Mg2+是DNA聚合酶發(fā)揮活性必需的輔助因子。6.1.2引物引物宜針對(duì)模板序列保守區(qū)域進(jìn)行設(shè)計(jì)，應(yīng)同時(shí)考慮長度、結(jié)構(gòu)、GC含量、Tm值等因素，使正向引物與探針距離近且不重疊、擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小適中，以獲得高特異性與高擴(kuò)增效率。引物本身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。6.1擴(kuò)增體系6方法6.1.3熒光化學(xué)物質(zhì)實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)使用的熒光物質(zhì)主要分為熒光探針和熒光染料，前者特異性較高，后者則會(huì)導(dǎo)致非特異性結(jié)果。目前臨床中以熒光探針最為常用，其具有高特異性、高信噪比等優(yōu)勢，可用于多重PCR反應(yīng)。熒光探針設(shè)計(jì)應(yīng)考慮長度、GC含量、Tm值等因素。現(xiàn)有探針類型包括：水解探針、分子信標(biāo)、雙雜交探針等。6.1擴(kuò)增體系6方法6.1.4熱穩(wěn)定DNA聚合酶實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)常采用熱穩(wěn)定DNA聚合酶，宜根據(jù)熱穩(wěn)定性、延伸速率、保真性等性能參數(shù)要求進(jìn)行選擇。其中Taq酶最為常用，具有良好的持續(xù)合成能力和高效的延伸速率；Tth酶耐熱性高，兼具反轉(zhuǎn)錄活性，可實(shí)現(xiàn)在同管中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增。對(duì)具特殊要求的該技術(shù)檢測項(xiàng)目，還可選擇其他類型聚合酶，例如：反轉(zhuǎn)錄酶、熱啟動(dòng)聚合酶、高保真聚合酶等。6.1擴(kuò)增體系6方法6.1.5dNTP實(shí)時(shí)熒光PCR體系中包含dATP、dCTP、dGTP和dTTP四種擴(kuò)增原料，其濃度應(yīng)為50μmol/L～200μmol/L。濃度過低會(huì)降低PCR產(chǎn)物的量，濃度過高則易與Mg2+結(jié)合，影響酶活性。四種dNTP應(yīng)等量。6.1.6模板實(shí)時(shí)熒光PCR僅需微量模板，樣本來源的其他物質(zhì)可能會(huì)抑制PCR反應(yīng)。為減少對(duì)PCR反應(yīng)的影響，應(yīng)考慮模板的最適加入量。6.1擴(kuò)增體系6方法6.1.7Mg2+及其濃度在實(shí)時(shí)熒光PCR體系中，Mg2+濃度以1.5mmol/L～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高時(shí)，酶活性過強(qiáng)，易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，降低反應(yīng)特異性；Mg2+濃度過低則會(huì)降低酶活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。商品化試劑盒的預(yù)混液中多含有固定預(yù)設(shè)濃度的MgCl2，必要時(shí)實(shí)驗(yàn)室可對(duì)Mg2+濃度進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的性能確認(rèn)。6.1.8擴(kuò)增體系配置擴(kuò)增反應(yīng)體系配制完成后應(yīng)在試劑盒推薦時(shí)間內(nèi)使用，以防止體系變質(zhì)（酶失活和探針淬滅）。開展臨床基因定性及定量檢測項(xiàng)目宜采用商品化試劑盒，試劑盒就擴(kuò)增體系各組分常采用預(yù)混液形式，應(yīng)根據(jù)說明書要求進(jìn)行配置，必要時(shí)可進(jìn)行優(yōu)化。6.1擴(kuò)增體系6方法6.2.1初始變性反應(yīng)溫度升高至95℃，孵育2分鐘～5分鐘，確保雙鏈DNA（dsDNA）被分離成單鏈DNA（ssDNA）以進(jìn)行后續(xù)擴(kuò)增。6.2.2變性反應(yīng)溫度升高至95℃，破壞dsDNA互補(bǔ)堿基間的氫鍵，形成ssDNA。變性溫度不宜過高、時(shí)間不宜過長，以免影響TaqDNA聚合酶活性、損害反應(yīng)體系中dNTP。6.2擴(kuò)增反應(yīng)6方法6.2.3退火反應(yīng)溫度降低至較引物Tm低5℃～10℃，以促進(jìn)引物與模板的結(jié)合。引物Tm的常用計(jì)算公式如下：Tm（℃）=2（NA

+NT）+4（

NG+NC

）·····································(1)式中：NA——引物序列中腺嘌呤（A）的個(gè)數(shù)；NT——引物序列中胸腺嘧啶（T）的個(gè)數(shù)；NG——引物序列中鳥嘌呤（G）的個(gè)數(shù)；NC——引物序列中胞嘧啶（C）的個(gè)數(shù)。反應(yīng)中引物的長度、堿基組成及其濃度是影響退火溫度選擇的主要原因。適宜的退火溫度是保證PCR擴(kuò)增特異性的重要前提。為提升擴(kuò)增特異性，可在推薦的Tm值范圍內(nèi)，選擇較高溫度進(jìn)行退火反應(yīng)，以減少引物和模板間的非特異性結(jié)合。6.2擴(kuò)增反應(yīng)6方法6.2.4延伸延伸反應(yīng)階段的溫度應(yīng)根據(jù)DNA聚合酶的最佳活性溫度設(shè)置，溫度過高不利于引物和模板結(jié)合。延伸反應(yīng)時(shí)間應(yīng)根據(jù)擴(kuò)增片段的長度選擇，延伸時(shí)間過長易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。對(duì)于低濃度模板的擴(kuò)增反應(yīng)，宜適當(dāng)延長延伸反應(yīng)時(shí)間。6.2.5循環(huán)次數(shù)本標(biāo)準(zhǔn)第6.2.2至第6.2.4條的變性、退火和延伸過程需重復(fù)循環(huán)，循環(huán)次數(shù)由起始模板量決定。循環(huán)次數(shù)設(shè)定在30～40次為宜，應(yīng)注意非特異性產(chǎn)物的量亦隨循環(huán)反應(yīng)次數(shù)而相應(yīng)增多。6.2擴(kuò)增反應(yīng)7污染預(yù)防和控制7.1.1實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測靈敏度高，樣本和目標(biāo)序列產(chǎn)物對(duì)檢測環(huán)境與反應(yīng)體系的污染可造成假陽性結(jié)果。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)注重污染對(duì)結(jié)果的影響，規(guī)范試驗(yàn)操作行為預(yù)防污染。7.1.2發(fā)生在該技術(shù)應(yīng)用過程中的污染根據(jù)不同情況，可分為以下幾類：a)根據(jù)污染核酸片段來源可分為：基因組核酸、擴(kuò)增產(chǎn)物、試劑質(zhì)控及標(biāo)準(zhǔn)品來源的合成性核酸序列污染。7.1污染來源7污染預(yù)防和控制b)根據(jù)污染播散形式可分為：攜帶污染、氣溶膠污染。c)根據(jù)被污染對(duì)象可分為：樣本間交叉污染、試劑污染、擴(kuò)增體系配制污染。7.1.3樣本間交叉污染多表現(xiàn)為個(gè)別樣本假陽性，試劑與擴(kuò)增體系配制污染多表現(xiàn)為批次假陽性。7.1污染來源7污染預(yù)防和控制7.2.1實(shí)驗(yàn)室分區(qū)7.2.1.1開展實(shí)時(shí)熒光PCR檢測時(shí)宜就實(shí)驗(yàn)室設(shè)置分區(qū)，試劑耗材儲(chǔ)存及檢測流程中的試劑配制、樣本制備、擴(kuò)增反應(yīng)及產(chǎn)物分析宜分別在相對(duì)獨(dú)立的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。分子病理實(shí)驗(yàn)室宜設(shè)置獨(dú)立的樣本前處理區(qū)，包括切片區(qū)和脫蠟區(qū)，用于組織切片、脫蠟、水化、染色等。脫蠟、水化及染色操作應(yīng)在通風(fēng)設(shè)施中進(jìn)行。如使用一體式自動(dòng)分析儀進(jìn)行樣本檢測，可根據(jù)設(shè)備實(shí)際功能，對(duì)分區(qū)進(jìn)行合并。7.2污染的預(yù)防7污染預(yù)防和控制7.2.1.2分區(qū)設(shè)計(jì)可因地制宜，根據(jù)所使用的技術(shù)平臺(tái)及檢測項(xiàng)目適當(dāng)調(diào)整區(qū)域設(shè)置，滿足生物安全與分子實(shí)驗(yàn)室污染控制要求即可。7.2.1.3應(yīng)就各區(qū)域設(shè)計(jì)單向工作流程，以減少污染發(fā)生。7.2.1.4各區(qū)域內(nèi)配備專用實(shí)驗(yàn)服、手套、移液器、一次性用品等。出入各區(qū)時(shí)對(duì)具潛在污染可能的防護(hù)裝備予以更換，以降低污染風(fēng)險(xiǎn)。7.2.1.5應(yīng)注意實(shí)驗(yàn)室分區(qū)間氣流流向，保證潛在可能污染物控制在特定區(qū)域內(nèi)。7.2污染的預(yù)防7污染預(yù)防和控制7.2.2分裝試劑7.2.2.1為預(yù)防污染，可對(duì)試劑進(jìn)行分裝。7.2.2.2配制或分裝試劑所用的物品、去離子水和緩沖液均應(yīng)做去核酸酶處理。7.2.2.3試劑配制或分裝應(yīng)在試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行。7.2.2.4實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)各類試劑的穩(wěn)定性制定分裝方案，確保試劑質(zhì)量。7.2污染的預(yù)防7污染預(yù)防和控制7.2.3檢測注意事項(xiàng)7.2.3.1實(shí)驗(yàn)室在工作前、工作后均應(yīng)進(jìn)行去核酸處理，包括：a)紫外線照射；b)使用0.5％～1％次氯酸鈉或75％乙醇擦拭或其他方式處理；c)運(yùn)用商品化核酸去除劑；d)保持實(shí)驗(yàn)室良好通風(fēng)。e)因次氯酸鈉具有較強(qiáng)腐蝕性，不可用次氯酸鈉直接處理儀器設(shè)備。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)檢測規(guī)模決定使用頻率，使用次氯酸鈉進(jìn)行去核酸處理后應(yīng)保持通風(fēng)，降低實(shí)驗(yàn)室空氣中的余氯含量。7.2污染的預(yù)防7污染預(yù)防和控制7.2.3.2檢測操作過程中應(yīng)重視以下要點(diǎn)：a)開蓋處理根據(jù)樣本風(fēng)險(xiǎn)，可在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行；b)實(shí)驗(yàn)應(yīng)使用帶濾芯的一次性加樣吸頭；c)移液器應(yīng)定期進(jìn)行去核酸處理；d)樣本開蓋前應(yīng)離心、靜置，有條件時(shí)可采取冰浴方式降低氣溶膠污染風(fēng)險(xiǎn)；e)操作過程中應(yīng)防止樣本間交叉污染。7.2污染的預(yù)防7污染預(yù)防和控制7.2.3.3不宜選用濃度過高的質(zhì)控品。質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)啟用后不能繼續(xù)存放于試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)，丟棄時(shí)應(yīng)閉管以防止泄露。7.2.3.4使用過的離心管、吸頭宜用0.5％～1％次氯酸鈉溶液浸泡后按醫(yī)療廢棄物處理。擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)采用醫(yī)療廢棄物包裝袋包裝，按醫(yī)療廢棄物管理要求統(tǒng)一處理。7.2.4預(yù)防擴(kuò)增產(chǎn)物污染7.2.4.1宜就擴(kuò)增反應(yīng)管的密閉性進(jìn)行驗(yàn)證。7.2.4.2去除擴(kuò)增產(chǎn)物殘留污染可采用尿嘧啶-DNA糖基水解酶(uracil-DNAglycosylas，UDG）法。7.2污染的預(yù)防7污染預(yù)防和控制7.3.1試劑監(jiān)測7.3.1.1利用未添加任何核酸模板的擴(kuò)增反應(yīng)液直接進(jìn)行擴(kuò)增，如結(jié)果陽性則表明試劑污染。7.3.1.2實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)各批次試劑及試劑分裝過程進(jìn)行監(jiān)測，防止使用已被污染的試劑。7.3.2操作過程監(jiān)測7.3.2.1開展日常臨床檢測時(shí)，應(yīng)合理設(shè)置陰性對(duì)照（可采用陰性質(zhì)控品，或以無菌水替代）監(jiān)測核酸檢測全程。7.3.2.2陰性對(duì)照不應(yīng)出現(xiàn)目標(biāo)片段擴(kuò)增，若檢測結(jié)果為陽性則表明實(shí)驗(yàn)過程中存在交叉污染或氣溶膠污染。7.3污染監(jiān)測7污染預(yù)防和控制7.3.3環(huán)境監(jiān)測7.3.3.1環(huán)境監(jiān)測可通過以下方法進(jìn)行：取容器盛裝無菌水，開蓋置于實(shí)驗(yàn)室工作臺(tái)面、生物安全柜臺(tái)面及核酸提取儀艙內(nèi)過夜，再與臨床樣本一起進(jìn)行檢測，如結(jié)果陽性則提示實(shí)驗(yàn)室存在氣溶膠污染；亦可取拭子擦拭實(shí)驗(yàn)室不同物品表面采集環(huán)境監(jiān)測樣本，置于含無菌水或樣本保存液的試管中，混勻后按臨床樣本進(jìn)行檢測。7.3.3.2依據(jù)實(shí)驗(yàn)室的檢測規(guī)模及陰性室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果制定環(huán)境監(jiān)測頻率。7.3污染監(jiān)測7污染預(yù)防和控制7.4.1待測樣本處理7.4.1.1如根據(jù)污染監(jiān)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在污染或污染可能時(shí)，應(yīng)先停止檢測工作與報(bào)告發(fā)布，分析并明確污染原因和嚴(yán)重程度后決定檢測結(jié)果是否可報(bào)告。7.4.1.2當(dāng)確認(rèn)污染系個(gè)別樣本交叉污染或環(huán)境中輕微氣溶膠污染時(shí)：對(duì)于報(bào)告陰性或陽性的檢測項(xiàng)目，結(jié)果為陰性的樣本可正常報(bào)告，結(jié)果為陽性的樣本應(yīng)排除污染再次復(fù)檢后方可報(bào)告；對(duì)于報(bào)告基因多態(tài)性的檢測項(xiàng)目，需排除污染原因后復(fù)檢。7.4污染的處理與控制7污染預(yù)防和控制7.4.2查找原因7.4.2.1實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定失控處理流程與措施，分析陰性質(zhì)控或環(huán)境監(jiān)測樣本失控的原因。7.4.2.2應(yīng)通過試劑監(jiān)測、操作過程監(jiān)測及不同區(qū)域環(huán)境監(jiān)測明確污染來源。7.4.2.3如疑似擴(kuò)增產(chǎn)物污染，可選用另一種與原擴(kuò)增試劑無交叉反應(yīng)的擴(kuò)增試劑進(jìn)行驗(yàn)證。7.4污染的處理與控制7污染預(yù)防和控制7.4.3清除污染7.4.3.1如因樣本產(chǎn)生氣溶膠污染，應(yīng)停止使用實(shí)驗(yàn)室。7.4.3.2無論何原因引起的實(shí)驗(yàn)室污染，均應(yīng)按一定程序進(jìn)行去核酸處理。宜先用75％乙醇、純凈水或核酸清除劑（不含腐蝕性成分）沉降氣溶膠，再經(jīng)紫外燈消毒30分鐘～60分鐘，然后用核酸清除劑或0.5％～1％次氯酸鈉溶液處理實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)、加樣器和地面，部分檢測器具可采用浸泡沖洗，最后予持續(xù)通風(fēng)處理。7.4.3.3每次按上述程序處理直至污染消除后再恢復(fù)實(shí)驗(yàn)室的使用。7.4污染的處理與控制8質(zhì)量管理8.1.1應(yīng)具備相應(yīng)分子生物學(xué)知識(shí)背景，接受過專門技術(shù)培訓(xùn)，取得PCR上崗證書。8.1.2實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定相關(guān)程序?qū)θ藛T進(jìn)行管理，保存所有人員記錄，以證明各類資格、資質(zhì)和培訓(xùn)考核等滿足要求。8.2實(shí)驗(yàn)室管理應(yīng)滿足《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法》要求，并取得所在省/市指定部門的技術(shù)審核合格證書方可開展相應(yīng)的臨床基因檢驗(yàn)工作。8.1人員管理8質(zhì)量管理8.3.1實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定設(shè)備選擇、購買和管理的文件化程序。8.3.2實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備其開展實(shí)時(shí)熒光PCR檢測所需的全部設(shè)備，包括樣本采集、處理、檢測和保存環(huán)節(jié)等。每臺(tái)設(shè)備應(yīng)有唯一標(biāo)識(shí)。8.3.3PCR實(shí)驗(yàn)室各物理分區(qū)中的設(shè)備為專用，應(yīng)設(shè)置有明確標(biāo)示，以避免設(shè)備未經(jīng)妥善處置即從原所在分區(qū)移動(dòng)至另一分區(qū)，造成不同工作區(qū)域間的交叉污染。8.3.4設(shè)備應(yīng)始終由經(jīng)培訓(xùn)的授權(quán)人員操作。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有設(shè)備安全操作、轉(zhuǎn)運(yùn)、保存和使用的程序，以防止設(shè)備污染或損壞。8.3.5實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保存每臺(tái)設(shè)備檢測性能的記錄，包括證明設(shè)備納入實(shí)驗(yàn)室時(shí)最初可接受使用的記錄、校準(zhǔn)記錄、維護(hù)維修記錄等。8.3設(shè)備管理8質(zhì)量管理8.3.6設(shè)備檢定和校準(zhǔn)8.3.6.1屬于國家規(guī)定應(yīng)接受強(qiáng)制檢定的計(jì)量器具的設(shè)備，應(yīng)按相關(guān)文件要求進(jìn)行檢定。8.3.6.2實(shí)驗(yàn)室應(yīng)評(píng)估每臺(tái)設(shè)備對(duì)結(jié)果有效性和計(jì)量溯源性的影響，合理地確定是否需要校準(zhǔn)。對(duì)不需要檢定和校準(zhǔn)的設(shè)備，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)核查其狀態(tài)是否滿足使用要求。8.3.6.3對(duì)需要校準(zhǔn)的設(shè)備，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立校準(zhǔn)方案，方案中應(yīng)包括該設(shè)備校準(zhǔn)的參數(shù)、范圍、不確定度和校準(zhǔn)周期等，以便送校時(shí)提出明確的、針對(duì)性的要求。8.3設(shè)備管理8質(zhì)量管理8.3.6.4設(shè)備校準(zhǔn)參數(shù)應(yīng)能滿足實(shí)驗(yàn)室所用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測項(xiàng)目的需求。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)校準(zhǔn)證書的信息，判斷設(shè)備是否滿足方法要求。如果校準(zhǔn)數(shù)據(jù)中包含修正因子，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)確保該修正因子得到適當(dāng)?shù)母潞蛻?yīng)用，以滿足規(guī)定要求。8.3.6.5以下實(shí)時(shí)熒光PCR檢測相關(guān)設(shè)備應(yīng)定期進(jìn)行校準(zhǔn)：全自動(dòng)核酸檢測系統(tǒng)、核酸提取儀、核酸擴(kuò)增儀、移液器、天平、溫度計(jì)、水浴箱、恒溫金屬浴、離心機(jī)、生物安全柜、分杯儀和自動(dòng)液體工作站。其中核酸提取儀具體校準(zhǔn)參數(shù)及要求見JJF1874，核酸擴(kuò)增儀校準(zhǔn)參數(shù)及要求見JJF1527。8.3設(shè)備管理8質(zhì)量管理8.3.7設(shè)備維護(hù)與維修8.3.7.1實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定文件化的預(yù)防性維護(hù)程序，該程序至少應(yīng)遵循制造商說明書的要求。8.3.7.2當(dāng)發(fā)現(xiàn)設(shè)備故障時(shí)，應(yīng)停止使用并清晰標(biāo)示。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)確保故障設(shè)備已經(jīng)修復(fù)并驗(yàn)證，當(dāng)其滿足規(guī)定的可接受標(biāo)準(zhǔn)后方可使用。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)檢查設(shè)備故障對(duì)之前檢測的影響，并采取應(yīng)急措施或糾正措施。8.3.7.3在設(shè)備投入使用前、維修前后或報(bào)廢前，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)采取適當(dāng)措施對(duì)設(shè)備去污染。8.3設(shè)備管理8質(zhì)量管理8.4.1驗(yàn)證計(jì)劃制定檢測方法用于臨床前，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)獨(dú)立進(jìn)行方法性能驗(yàn)證。驗(yàn)證時(shí)，實(shí)驗(yàn)室可通過獲取客觀證據(jù)（以性能特征形式）證實(shí)檢驗(yàn)程序的性能與試劑盒的聲明相符，同時(shí)應(yīng)滿足臨床對(duì)檢測結(jié)果預(yù)期用途的要求。8.4.2樣本選擇宜選擇受檢者真實(shí)樣本，盡量與試劑盒建立性能指標(biāo)時(shí)所用材料一致。當(dāng)目標(biāo)樣本不易獲得時(shí)，可考慮使用穩(wěn)定的質(zhì)控品、標(biāo)準(zhǔn)品或參考物質(zhì)。當(dāng)一份樣本需進(jìn)行多次試驗(yàn)時(shí)，宜對(duì)其進(jìn)行分裝并低溫保存，避免反復(fù)凍融。8.4方法性能驗(yàn)證8質(zhì)量管理8.4.3定性方法的驗(yàn)證8.4.3.1總體要求定性檢測項(xiàng)目驗(yàn)證指標(biāo)宜包括方法符合率、檢出限、抗干擾能力等。8.4.3.2符合率通過與參比方法進(jìn)行比較。參比方法包括但不限于：金標(biāo)準(zhǔn)方法、行業(yè)公認(rèn)方法、經(jīng)驗(yàn)證性能符合要求滿足臨床預(yù)期用途的方法（例如：通過ISO15189認(rèn)可實(shí)驗(yàn)室使用的相同檢測方法）。通常按照受檢者樣本檢驗(yàn)程序，采用參比方法和候選方法平行檢測。將所有檢測結(jié)果按四格表匯總填表，計(jì)算陽性符合率、陰性符合率和總符合率。8.4方法性能驗(yàn)證8質(zhì)量管理8.4.3.3檢出限如試劑使用說明書有檢出限的聲明，在有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或以定量形式表達(dá)定性結(jié)果時(shí)，所用檢測方法應(yīng)進(jìn)行檢出限的驗(yàn)證。驗(yàn)證時(shí)，將定值參考物質(zhì)（例如：國際參考品、國家參考品、試劑盒參考品）樣本梯度稀釋至試劑盒聲明的檢出限濃度，重復(fù)測定，按照90％或95％置信區(qū)間統(tǒng)計(jì)。稀釋液可根據(jù)情況選用試劑盒提供的稀釋液或陰性血清，該陰性血清除被驗(yàn)證的目標(biāo)物應(yīng)陰性外，所含干擾物質(zhì)濃度應(yīng)在試劑盒聲明的范圍之內(nèi)。8.4方法性能驗(yàn)證8質(zhì)量管理8.4.3.4抗干擾能力PCR檢測常見的干擾物質(zhì)主要包括血紅蛋白、肝素、苯酚、乙醇、異丙醇、乙酸鈉等。實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)臨床需求、試劑盒聲明和樣本特點(diǎn)（實(shí)際可能存在的干擾物質(zhì)及達(dá)到的濃度）選擇需要驗(yàn)證的干擾物質(zhì)及濃度。實(shí)驗(yàn)室可就抗凝劑和樣本保存液等試劑對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測結(jié)果的影響單獨(dú)進(jìn)行評(píng)估。8.4.4定量方法的驗(yàn)證8.4.4.1總體要求定量檢測項(xiàng)目分析性能驗(yàn)證指標(biāo)宜包括測量正確度、測量精密度（含重復(fù)性和中間精密度）、抗干擾能力、定量限、線性區(qū)間、可報(bào)告區(qū)間、核酸提取效率、擴(kuò)增效率等。8.4方法性能驗(yàn)證8質(zhì)量管理8.4.4.2正確度對(duì)測量正確度的評(píng)價(jià)，首選方法是分析定值參考物質(zhì)，其次選擇使用實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證的正確度驗(yàn)證數(shù)據(jù)。推薦的參考物質(zhì)為具有互換性的有證參考物質(zhì)及具有溯源性及互換性的正確度驗(yàn)證物質(zhì)。參考物質(zhì)至少選擇2個(gè)濃度水平，至少其中一個(gè)水平為醫(yī)學(xué)決定水平。使用受檢者樣本進(jìn)行正確度驗(yàn)證時(shí)首選參考方法，參考方法不易獲得時(shí)，可選擇已得到臨床驗(yàn)證的常規(guī)方法。如果是更新試劑盒，應(yīng)與現(xiàn)在使用的試劑盒進(jìn)行比較。8.4.4.3測量精密度應(yīng)同時(shí)驗(yàn)證重復(fù)性和中間精密度。用于精密度驗(yàn)證的樣本應(yīng)具有很好的穩(wěn)定性和均一性。至少含兩個(gè)濃度水平，應(yīng)盡可能與試劑盒精密度評(píng)價(jià)時(shí)所用樣本濃度一致，宜確定醫(yī)學(xué)決定水平處的精密度。8.4方法性能驗(yàn)證8質(zhì)量管理8.4.4.4抗干擾能力見本標(biāo)準(zhǔn)第8.4.3.4條，驗(yàn)證在特定種類和濃度水平干擾物質(zhì)存在的條件下，檢測結(jié)果仍然符合檢測方法規(guī)定的要求。8.4.4.5定量限定量限是指在一定實(shí)驗(yàn)條件下，檢測系統(tǒng)能夠得到可靠結(jié)果的被測物最低濃度，其總誤差符合實(shí)驗(yàn)室預(yù)期要求（臨床可接受），是定量分析方法實(shí)際能可靠測定的某組分的下限。建立定量限宜根據(jù)臨床需求和試劑盒選定的性能規(guī)范的允許誤差來設(shè)定準(zhǔn)確度目標(biāo)，最常見的是設(shè)定總誤差目標(biāo)值。并預(yù)先確定預(yù)期的定量限的目標(biāo)濃度，在該濃度下制備多個(gè)低濃度水平樣本。8.4方法性能驗(yàn)證8質(zhì)量管理8.4.4.6線性區(qū)間所用樣本應(yīng)盡可能與受檢者樣本相似，不含有說明書上指出的干擾物，受檢者樣本是線性驗(yàn)證的理想樣本?？衫酶摺⒌蜐舛鹊臉颖九渲撇煌瑵舛葮颖?，高、低濃度值應(yīng)在試劑盒聲明的線性區(qū)間上下限附近。若不易獲得高濃度樣本，可通過向受檢者樣本中添加測定物（加入量小于總體積10％）獲得；若不易獲得低濃度樣本，可通過已驗(yàn)證不含被測物的受檢者樣本稀釋陽性受檢者樣本獲得。8.4方法性能驗(yàn)證8質(zhì)量管理8.4.4.7可報(bào)告范圍當(dāng)驗(yàn)證的線性范圍上限不能滿足臨床需求時(shí)，應(yīng)進(jìn)行可報(bào)告范圍驗(yàn)證。定量分析方法的可報(bào)告范圍是臨床實(shí)驗(yàn)室發(fā)布檢測報(bào)告的依據(jù)之一，可報(bào)告范圍的驗(yàn)證包括可報(bào)告低限（定量下限）與可報(bào)告高限（定量上限×樣本最大稀釋倍數(shù)）。選擇在線性范圍內(nèi)高值樣本，用試劑盒配套或指定的稀釋液分別做10、100和1000倍等倍比稀釋，稀釋后的理論值不應(yīng)低于定量下限，每份樣本至少測定2次取平均值，計(jì)算各稀釋度的理論值與實(shí)測值對(duì)數(shù)值的差值，差值（例如偏差）應(yīng)滿足實(shí)驗(yàn)室和行業(yè)的質(zhì)量要求。8.4方法性能驗(yàn)證8質(zhì)量管理8.4.4.8核酸提取效率當(dāng)懷疑核酸提取效率存在問題，應(yīng)就核酸模板提取質(zhì)量進(jìn)行驗(yàn)證，見本標(biāo)準(zhǔn)第5.5.6條。8.4.4.9核酸擴(kuò)增效率當(dāng)懷疑PCR擴(kuò)增系統(tǒng)存在問題，應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增效率驗(yàn)證。擴(kuò)增效率包括樣本和標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增效率兩部分，僅在兩者擴(kuò)增效率良好且一致時(shí)，定量結(jié)果才準(zhǔn)確。8.4.5臨床驗(yàn)證臨床檢測方法在啟用前后，實(shí)驗(yàn)室均宜選取臨床明確診斷的受檢者樣本，進(jìn)行方法學(xué)性能評(píng)價(jià)，以驗(yàn)證檢測方法達(dá)到臨床應(yīng)用的規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)要求。評(píng)價(jià)指標(biāo)可包括：臨床靈敏度和特異性、陽性和陰性預(yù)測值、陽性和陰性似然比等。8.4方法性能驗(yàn)證8質(zhì)量管理8.5.1總體要求8.5.1.1實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立內(nèi)部質(zhì)量控制程序以驗(yàn)證達(dá)到預(yù)期的結(jié)果質(zhì)量。8.5.1.2實(shí)驗(yàn)室應(yīng)使用與受檢者樣本組分和基質(zhì)相似的質(zhì)控品，定期檢測質(zhì)控品，檢測頻率應(yīng)基于檢驗(yàn)程序的穩(wěn)定性和錯(cuò)誤結(jié)果對(duì)受檢者危害的風(fēng)險(xiǎn)而確定。8.5.1.3實(shí)驗(yàn)室宜選擇醫(yī)學(xué)決定水平或與其值接近的質(zhì)控品濃度，以保證決定值的有效性。8.5.1.4根據(jù)質(zhì)控品性質(zhì)決定是否參加抽提，室內(nèi)質(zhì)控宜覆蓋從抽提至實(shí)時(shí)熒光PCR檢測的全過程。8.5室內(nèi)質(zhì)量控制8質(zhì)量管理8.5.2核酸提取的質(zhì)量控制8.5.2.1總體要求在實(shí)時(shí)熒光PCR檢測過程中，可通過設(shè)立內(nèi)對(duì)照進(jìn)行核酸提取的質(zhì)量控制。如果本批實(shí)驗(yàn)無內(nèi)對(duì)照擴(kuò)增，則提示樣本內(nèi)存在抑制物/干擾物，可通過重新抽提核酸清除或減少抑制物/干擾物。8.5.2.2內(nèi)源性內(nèi)對(duì)照常采用人體細(xì)胞中的管家基因。內(nèi)源性內(nèi)對(duì)照既可以監(jiān)測采樣質(zhì)量，又可以監(jiān)測核酸提取到產(chǎn)物分析全過程的有效性。8.5.2.3外源性內(nèi)對(duì)照常用人工合成的假病毒或質(zhì)粒，在核酸提取前摻入樣本中，與目標(biāo)序列同時(shí)提取和擴(kuò)增，可監(jiān)測從核酸提取到產(chǎn)物分析全過程的有效性，但不能反映采樣質(zhì)量。8.5室內(nèi)質(zhì)量控制8質(zhì)量管理8.5.3擴(kuò)增反應(yīng)的質(zhì)量控制8.5.3.1定性檢測項(xiàng)目，每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)置陰性、弱陽性和/或陽性質(zhì)控品。8.5.3.2定量檢測項(xiàng)目，每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)置陰性、弱陽性和陽性質(zhì)控品。8.5.3.3如為基因突變、基因多態(tài)性或基因型檢測，則應(yīng)包括最能反映檢測情況的突變或基因型樣本，每批檢測的質(zhì)控至少應(yīng)有一種基因突變或基因型。宜設(shè)置某一時(shí)間周期，令周期內(nèi)各批次檢測所設(shè)置質(zhì)控品監(jiān)測位點(diǎn)合計(jì)可覆蓋該檢測項(xiàng)目所包含的所有位點(diǎn)。8.5室內(nèi)質(zhì)量控制8質(zhì)量管理8.5.3.4擴(kuò)增反應(yīng)的質(zhì)量控制至少涵蓋提取的核酸模板質(zhì)量、反應(yīng)體系（酶濃度與活性、離子活度、升降溫控制等）、陰性和陽性（特別是臨界弱陽性）對(duì)照設(shè)置等方面。8.5.3.5對(duì)于定量測定，除陰、陽性質(zhì)控符合要求外，還應(yīng)考慮每次實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增效率（斜率、截距、相關(guān)系數(shù)）符合規(guī)定。8.5.4質(zhì)控結(jié)果的判讀8.5.4.1實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立質(zhì)量控制程序以保證檢測結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。8.5.4.2當(dāng)違反質(zhì)控規(guī)則，且檢測結(jié)果可能存在明顯錯(cuò)誤時(shí)，應(yīng)拒絕接受結(jié)果，在糾正并驗(yàn)證性能合格后重新檢測受檢者樣本。8.5室內(nèi)質(zhì)量控制8質(zhì)量管理8.5.4.3發(fā)現(xiàn)失控后，應(yīng)對(duì)操作、試劑、儀器、人員、污染等環(huán)節(jié)進(jìn)行全過程分析，查找失控原因。失控實(shí)驗(yàn)室還應(yīng)評(píng)估最后一次成功質(zhì)控活動(dòng)之后受檢者樣本的檢測結(jié)果。8.5.5質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)處理8.5.5.1實(shí)驗(yàn)室應(yīng)定期評(píng)審質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)，以發(fā)現(xiàn)可能提示檢測系統(tǒng)問題的檢測性能變化趨勢。8.5.5.2發(fā)現(xiàn)此類趨勢時(shí)應(yīng)采取預(yù)防措施并記錄。8.5.5.3宜盡量采用統(tǒng)計(jì)學(xué)和非統(tǒng)計(jì)學(xué)過程控制技術(shù)連續(xù)監(jiān)測檢測系統(tǒng)的性能，通常繪制室內(nèi)質(zhì)控圖，每月或間隔特定周期對(duì)室內(nèi)質(zhì)控進(jìn)行總結(jié)和記錄。8.5室內(nèi)質(zhì)量控制8質(zhì)量管理8.6.1總體要求8.6.1.1實(shí)驗(yàn)室應(yīng)參加實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)計(jì)劃（例如：外部質(zhì)量評(píng)價(jià)計(jì)劃或能力驗(yàn)證計(jì)劃），監(jiān)控實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)計(jì)劃的結(jié)果，以保證實(shí)驗(yàn)室間檢測結(jié)果的可比性。8.6.1.2當(dāng)不符合預(yù)定的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)實(shí)施糾正措施。8.6.1.3室間質(zhì)量結(jié)果評(píng)價(jià)可參考WS/T414執(zhí)行。8.6.1.4當(dāng)無實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)計(jì)劃可利用時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)采取其他方案并提供客觀證據(jù)確定檢測結(jié)果的可接受性。8.6.1.5實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立參加實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)的程序，該程序包括職責(zé)規(guī)定、參加說明，以及任何不同于實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)計(jì)劃的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。8.6實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)8質(zhì)量管理8.6.1.6實(shí)驗(yàn)室選擇的實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)計(jì)劃應(yīng)盡量提供貼近臨床實(shí)際的、模擬受檢者樣本的比對(duì)試驗(yàn)，盡可能覆蓋包括分析前和分析后程序的全部檢測過程。8.6.2替代方案8.6.2.1當(dāng)無實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)計(jì)劃可利用時(shí)，實(shí)驗(yàn)室可尋找其他有相關(guān)檢測資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室，按照上述方法定期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)，每年不宜少于2次；或采取其他方案并提供客觀證據(jù)確定檢測結(jié)果的可接受性，這些方案應(yīng)盡可能使用適宜的物質(zhì)。8.6.2.2適宜物質(zhì)包括：有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣本；以前檢測過的樣本；細(xì)胞庫或組織庫中的物質(zhì)；與其他實(shí)驗(yàn)室的交換樣本；實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)計(jì)劃中日常測試的質(zhì)控品。8.6實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)8質(zhì)量管理8.6.3檢測結(jié)果的可比性8.6.3.1當(dāng)實(shí)驗(yàn)室所開展檢測項(xiàng)目就檢驗(yàn)程序、設(shè)備、地點(diǎn)、人員中任一情況存在不同時(shí)，應(yīng)規(guī)定比較程序和所用設(shè)備及方法，并