醫(yī)院培訓(xùn)課件：《猴痘病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)》

猴痘病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)1

50nm全

球

流

行

情

況2https://worldhealthorg.shinyapps.io/mpx_global/1970第一例人感染猴痘病毒2022.5全球范圍內(nèi)持續(xù)增多的猴痘病例2022.7.23猴痘疫情構(gòu)成“國(guó)際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件”2023.5.13猴痘疫情不再構(gòu)成“國(guó)際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件”2022.9.16重慶報(bào)道我國(guó)第一例猴痘2023.6.6北京報(bào)道2例猴痘2023.6.10廣州報(bào)道2例猴痘歐洲美洲1958發(fā)現(xiàn)

猴痘病毒50nm相

關(guān)

指

南350nm生

物

學(xué)

特

性4痘病毒科，正痘病毒屬

猴痘病毒、天花病毒、痘苗病毒和牛痘病毒等形態(tài)結(jié)構(gòu)：圓角磚形或卵圓形，大小為200nm×250nm，外周有30nm的外膜，環(huán)繞勻質(zhì)的核心體培養(yǎng)特性：在人、猴、鼠、兔等來(lái)源的細(xì)胞和雞胚絨毛尿囊膜中生長(zhǎng)良好并引起細(xì)胞病變Mpoxvirus生

物

學(xué)

特

性全長(zhǎng)約為197kb的雙鏈DNA病毒基因組未端為長(zhǎng)約6kb的反向重復(fù)序列，呈發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)190個(gè)開放讀碼框特異性基因片段：F3L、B6R、ATl、G2R等YudaChen,ChangchengWu,RuhanA,etal.Perspectiveontheapplicationofgenomesequencingfor

monkeypox

virussurveillance.VirologicaSinica.2023,38(2）：327-333.生

物

學(xué)

特

性CladeII（死亡率約3.6%）

CladeI（死亡率約10.6%）西非分支cladeII剛果盆地分支cladeI生

物

學(xué)

特

性7耐干燥和低溫在土壤、痂皮和衣被上可生存數(shù)月該病毒對(duì)熱敏感，加熱至56℃30分鐘或60℃10分鐘即可滅活紫外線和一般消毒劑均可使之滅活，對(duì)次氯酸鈉、氯二甲酚、戊二醛、甲醛和多聚甲醛等敏感流

行

病

學(xué)宿主：猴痘病毒的主要宿主為非洲嚙齒類（非洲松鼠、樹松鼠、岡比亞袋鼠、睡鼠等），靈長(zhǎng)類（多種猴類和猿類）由于與感染的嚙齒類動(dòng)物接觸偶可感染。傳染源：

感染動(dòng)物及猴痘病毒感染者是主要傳染源。流

行

病

學(xué)傳播途徑：病毒經(jīng)黏膜和破損皮膚侵入人體。接觸感染動(dòng)物的呼吸道分泌物、病變滲出物、血液、其它體液，或被感染動(dòng)物咬傷、抓傷而感染。人與人之間主要通過密切接觸傳播，亦可在長(zhǎng)時(shí)間近距離接觸時(shí)通過飛沫傳播，接觸病毒污染的物品也有可能感染。母嬰傳播。流

行

病

學(xué)易感人群：未接種過天花疫苗的人群對(duì)猴痘病毒普遍易感。既往接種過天花疫苗者對(duì)猴痘病毒存在一定程度的交叉保護(hù)力。臨

床

癥

狀潛伏期：5～21天，多為6～13天。癥狀：前驅(qū)期---發(fā)熱（38.5℃以上）、寒戰(zhàn)、頭痛、嗜睡、乏力、背

部疼痛和肌痛、淺表淋巴結(jié)腫大等。皮疹期---斑疹、丘疹、皰疹、膿皰和結(jié)痂。ReedKD,MelskiJW,GrahamMB,etal.ThedetectionofmonkeypoxinhumansintheWesternHemisphere.NEnglJMed.2004Jan22;350(4):342-50.12高致病性病毒實(shí)

驗(yàn)

室

檢

測(cè)《人間傳染的病原微生物名錄》——第一類生物危害涉及活病毒的樣本滅活操作在生物安全三級(jí)（BSL-3）及以上實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行滅活樣本病毒的DNA提取可在生物安全二級(jí)（BSL-2）實(shí)驗(yàn)室（個(gè)人三級(jí)防護(hù)）采集雙份樣本，一份滅活，一份非滅活。實(shí)

驗(yàn)

室

檢

測(cè)13一、樣本采集、保存和運(yùn)輸1.采樣人員個(gè)人防護(hù)裝備要求N95或以上防護(hù)口罩、護(hù)目鏡或面罩、連體防護(hù)服、雙層乳膠手套、防水靴套；如果接觸了患者血液、體液、分泌物或排泄物，應(yīng)及時(shí)更換外層乳膠手套。實(shí)

驗(yàn)

室

檢

測(cè)14一、樣本采集、保存和運(yùn)輸2.標(biāo)本采集種類（1）皮膚病變標(biāo)本（痘皰液、病變皮疹、痘皰表皮或痘痂、痘皰表面和/或滲出物的拭子）（2）急性期呼吸道標(biāo)本（咽拭子）（3）血液標(biāo)本（急性期、恢復(fù)期雙份血清。第一份血清最好在發(fā)病后7天內(nèi)釆集，第二份血清應(yīng)在發(fā)病后第3～4周釆集。）（4）其他材料（直腸和/或生殖器拭子、尿液、精液等）實(shí)

驗(yàn)

室

檢

測(cè)15一、樣本采集、保存和運(yùn)輸3.標(biāo)本采集方法（1）病變皮疹、痘皰表面和/或滲出物的拭子：使用無(wú)菌聚酯或滌綸拭子用力涂抹病變部位，以確保收集足夠的病毒DNA，將拭子放置無(wú)菌收集管中。實(shí)

驗(yàn)

室

檢

測(cè)16一、樣本采集、保存和運(yùn)輸3.標(biāo)本采集方法（2）痘皰液:用酒精棉球?qū)ζp處進(jìn)行消毒，并自然干燥。用無(wú)菌針頭和注射器吸取液體，放置于1.5至2毫升的無(wú)菌帶O型橡膠圈的螺旋蓋塑料管。實(shí)

驗(yàn)

室

檢

測(cè)17一、樣本采集、保存和運(yùn)輸3.標(biāo)本采集方法（3）皮疹或痘皰表皮、皮疹內(nèi)液體拭子采集：用酒精棉球?qū)ζp處進(jìn)行消毒，并自然干燥。用一次性手術(shù)刀（或無(wú)菌26號(hào)針頭）打開并移除小泡或膿皰的頂部皮膚，將小泡頂部皮膚放置于1.5至2毫升的無(wú)菌帶O型橡膠圈的螺旋蓋塑料管中。用無(wú)菌聚酯或滌綸拭子擦拭皮損底部，將拭子放置于無(wú)菌收集管中。實(shí)

驗(yàn)

室

檢

測(cè)18一、樣本采集、保存和運(yùn)輸3.標(biāo)本采集方法（4）痘痂或硬皮:用酒精棉球?qū)ζp處進(jìn)行消毒，并自然干燥。用無(wú)菌26號(hào)針頭或剪刀取至少4塊痂皮，每塊痂皮要來(lái)自不同的身體部位。將痂皮放置于1.5至2毫升的無(wú)菌帶O型橡膠圈的螺旋蓋塑料管中。實(shí)

驗(yàn)

室

檢

測(cè)19一、樣本采集、保存和運(yùn)輸3.標(biāo)本采集方法將兩個(gè)相同類型的病變標(biāo)本收集在一個(gè)管中，最好是從身體的不同部位收集的，且外觀不同。不同類型病變（如痘皰液和痘痂）不能放在同一管中。采樣時(shí)建議采雙份樣本，一管用滅活型病毒采樣管，另一管為無(wú)菌螺旋蓋管（無(wú)液體）（因猴痘病毒在干燥環(huán)境中比較穩(wěn)定）。實(shí)

驗(yàn)

室

檢

測(cè)20一、樣本采集一、樣本采集、保存和運(yùn)輸3.標(biāo)本采集方法（5）咽拭子：用2根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子同時(shí)擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，將拭子放入無(wú)菌采樣管中，尾部棄去，旋緊管蓋。實(shí)

驗(yàn)

室

檢

測(cè)21一、樣本采集、保存和運(yùn)輸3.標(biāo)本采集方法（6）血液標(biāo)本：盡量釆集急性期、恢復(fù)期雙份血清。第一份血清應(yīng)盡早（最好在發(fā)病后7天內(nèi)）釆集，第二份血清應(yīng)在發(fā)病后第3～4周釆集。采集量5ml，以空腹血為佳，EDTA抗凝。室溫靜置30分鐘，1500～2000rpm離心10分鐘，分別收集血漿和血液中細(xì)胞于無(wú)菌螺口塑料管中。實(shí)

驗(yàn)

室

檢

測(cè)22一、樣本采集、保存和運(yùn)輸4.標(biāo)本運(yùn)輸標(biāo)本應(yīng)在收集后一小時(shí)內(nèi)冷藏（2～8℃）或冷凍（-20℃或更低），并盡快進(jìn)行檢測(cè)。能在一周以內(nèi)檢測(cè)的標(biāo)本可置于4℃保存。暫時(shí)無(wú)法檢測(cè)的標(biāo)本，短期可在-20℃中保存，長(zhǎng)期應(yīng)置于-70℃以下保存（收集后>60天）。實(shí)

驗(yàn)

室

檢

測(cè)23一、樣本采集、保存和運(yùn)輸5.標(biāo)本送檢（1）上送標(biāo)本：病例標(biāo)本先由省級(jí)及以下疾控機(jī)構(gòu)進(jìn)行初步檢測(cè)，猴痘陽(yáng)性標(biāo)本送中國(guó)疾控中心病毒病所復(fù)核。（2）運(yùn)輸：UN2814，準(zhǔn)運(yùn)證書實(shí)

驗(yàn)

室

檢

測(cè)24二、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)實(shí)

驗(yàn)

室

檢

測(cè)25三、核酸檢測(cè)試劑準(zhǔn)備核酸提取結(jié)果分析報(bào)告樣本前處理核酸擴(kuò)增實(shí)

驗(yàn)

室

檢

測(cè)26三、核酸檢測(cè)1.試劑準(zhǔn)備商品化試劑盒合成引物探針對(duì)照陰性對(duì)照（水）陽(yáng)性對(duì)照（涵蓋檢測(cè)部位序列的質(zhì)粒）儲(chǔ)備2個(gè)及以上廠家試劑盒，相互驗(yàn)證。實(shí)

驗(yàn)

室

檢

測(cè)27三、核酸檢測(cè)2.樣本前處理（1）痘皰液：將痘皰液用適當(dāng)體積的含PS的PBS或DMEM重懸：

100μL樣本+80μL緩沖液，總量為180μL。樣本不足100μL時(shí)用緩沖液補(bǔ)足至總量180μL。實(shí)

驗(yàn)

室

檢

測(cè)28三、核酸檢測(cè)2.樣本前處理（2）病變皮疹或痘痂：取1塊痂皮按質(zhì)量/體積（1mg:5μL）加入相應(yīng)體積含PS的PBS，研磨或勻漿處理，取80μL，然后加入100μL緩沖液。滅活型采樣管對(duì)痘痂、痘皮組織中病毒滅活效果可能仍比較差，且在核酸提取過程中需要對(duì)樣本進(jìn)行粉碎處理，因此不建議在BSL-2實(shí)驗(yàn)室處理痘痂和痘皮樣本。實(shí)

驗(yàn)

室

檢

測(cè)29三、核酸檢測(cè)2.樣本前處理（3）咽拭子、其它拭子：若拭子在樣本保存液中可直接取200μL樣本，若為干拭子可用3ml含PS的PBS或DMEM重懸，然后取200μL樣本。（4）全血或血清：直接取200μL樣本。實(shí)

驗(yàn)

室

檢

測(cè)30三、核酸檢測(cè)3.核酸提取組織基因組DNA提取試劑盒血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒實(shí)

驗(yàn)

室

檢

測(cè)31三、核酸檢測(cè)4.核酸擴(kuò)增（1）反應(yīng)體系實(shí)

驗(yàn)

室

檢

測(cè)32三、核酸檢測(cè)4.核酸擴(kuò)增（2）反應(yīng)程序選擇Fam熒光信號(hào)檢測(cè)通道，收集設(shè)在60℃。實(shí)

驗(yàn)

室

檢

測(cè)33三、核酸檢測(cè)（1）結(jié)果分析閾值設(shè)定:基線取3-10或6-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)。閾值設(shè)定原則為閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照品擴(kuò)增曲線最高點(diǎn)，也可根儀器噪音情況調(diào)整閾值。5.結(jié)果分析實(shí)

驗(yàn)

室

檢

測(cè)34三、核酸檢測(cè)（2）Real-timePCR反應(yīng)系統(tǒng)的質(zhì)量控制：反應(yīng)結(jié)果應(yīng)同時(shí)符合以下2個(gè)條件，否則試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效，應(yīng)重新開展檢測(cè)。陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增，為陰性。陽(yáng)性對(duì)照未出現(xiàn)陰性結(jié)果。5.結(jié)果分析實(shí)

驗(yàn)

室

檢

測(cè)35三、核酸檢測(cè)（3）結(jié)果判定：A.陰性：雙孔Ct>37，或無(wú)Ct值；B.灰區(qū)：一孔Ct值>37；C.陽(yáng)性：雙孔Ct值<37。5.結(jié)果分析實(shí)

驗(yàn)

室

檢

測(cè)36三、核酸檢測(cè)5.結(jié)果分析陽(yáng)性結(jié)果：所有陽(yáng)性和處于灰區(qū)的樣本應(yīng)重復(fù)檢測(cè)或經(jīng)序列分析進(jìn)行確診。建立復(fù)檢流程。陰性結(jié)果：當(dāng)樣本僅為咽拭子或血清、血漿時(shí)，且檢測(cè)結(jié)果為陰性時(shí)，應(yīng)結(jié)合臨床癥狀，慎重做出陰性診斷。實(shí)

驗(yàn)

室

檢

測(cè)37三、核酸檢測(cè)6.鑒別診斷主要和其他發(fā)熱出疹性疾病鑒別：水痘、帶狀皰疹、單純皰疹、麻疹、登革熱等。實(shí)

驗(yàn)

室

檢

測(cè)38四、測(cè)序分析13文庫(kù)構(gòu)建2數(shù)據(jù)分析4核酸提取上機(jī)測(cè)序?qū)?/p>

驗(yàn)

室

檢

測(cè)39四、測(cè)序分析/gwh/poxvirus//hmpxv-variants//

ReconstructedancestralMPXV(ancestral)HumanMonkeypox(hMPXV)——MPXV-M5312_HM12_Rivers(NC_063383.1)hMPXV_B1——MPXV_USA_2022_MA001inNC_063383coordinates(pseudo_ON563414)自定義參考株參考序列實(shí)

驗(yàn)