海南火龍果中蛋白的提取及鑒定

引言火龍果又被叫做仙蜜果、情人果、紅龍果，最早在南美洲的熱帶地區(qū)種植，屬于仙人掌科三角屬多年生多漿植物果實[1-5]?；瘕埞粌H有很大的參觀和賞玩價值，是“花果兼賞，賞食兼用”的綠色園林植物[4]。其果肉又分為白色和紅色，紅色口味相對較為甜蜜，而白色口感比較清爽。古籍《普濟方》記載，火龍果營養(yǎng)價值較高，有促腸排便、降三高和保護視力的作用。因為火龍果中含有花青素這樣一種特殊的成分，所以它還具有促進腸胃蠕動、預(yù)防貧血、美白皮膚和防黑斑的功效[2]?；瘕埞?、花卉、蔬菜、保健、醫(yī)藥于一體?；瘕埞饧肮ぶ卸几缓烊患t色素，該天然紅色素是一種具有抗增殖活性、抗氧化以及抗菌的生物色素[3]。此外，海南火龍果果肉可用來加工果醬、果酒、果汁和罐頭等各種營養(yǎng)保健食品[3,5]。隨著科學(xué)技術(shù)進步以及經(jīng)濟發(fā)展，我國南方省份火龍果種植產(chǎn)業(yè)持續(xù)擴大，已成為多省分特色農(nóng)業(yè)鄉(xiāng)村振興的重要抓手。雖然已有少量關(guān)于火龍果中化學(xué)成分的活性研究，但是大多數(shù)是關(guān)于火龍果的種植和培育的研究，對其中含有的蛋白質(zhì)研究很鮮有。尤其是海南盛產(chǎn)火龍果，很有必要研究其中的生物大分子名稱和種類。盡管我國火龍果種植業(yè)正處于發(fā)展蓬勃期，但當(dāng)下火龍果副產(chǎn)品加工體系仍處于發(fā)展初期，尤其是深入研究火龍果作為水果具有較高營養(yǎng)價值的物質(zhì)基礎(chǔ)很少，因此開展火龍果蛋白質(zhì)的研究具有良好的應(yīng)用前景和推廣意義[3]。本文通過提取及鑒定火龍果蛋白，旨在為火龍果的藥用保健價值及其潛在的保鮮應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，進而提升火龍果深加工的附加值[3]；另外，作為一種海南地道產(chǎn)食用價值很高的水果，研究其所含蛋白可以為深入開發(fā)和利用火龍果提供理論依據(jù)。對海南熱帶水果的研究和發(fā)展也具有一定的理論和實踐意義[1-5]。當(dāng)然，高效地從本實驗樣品海南樂東產(chǎn)紅心火龍果中提取蛋白是最為關(guān)鍵的一步。現(xiàn)有研究中關(guān)于如何提取植物蛋白方法主要是優(yōu)化后的BPP+酚抽提法、三氯乙酸—丙酮沉淀法以及水溶劑提取法這三種方法[6-9]。其中水溶劑提取法實驗操作簡潔、蛋白提取率高，但是實驗成本較高且實驗試劑不穩(wěn)定也是該方法較為突出的缺點。而三氯乙酸—丙酮沉淀法相對于其他方法來說，提取率和提取蛋白程度均較高，但是該方法操作繁瑣且同樣存在實驗花費較多且試劑不穩(wěn)定的缺點，因此目前使用該方法的研究較少[6]。傳統(tǒng)酚法未在植物蛋白中被大量運用的根本理由就是該方法在植物組織中提取的蛋白質(zhì)含量很低。而本研究所采用的優(yōu)化后的BPP+酚提取法相較于傳統(tǒng)的酚提取法，可以更有效地從海南樂東產(chǎn)紅心火龍果的植物組織中提取到較高質(zhì)量的蛋白質(zhì)，不僅能改善提取的效率，還可以減少并降低對蛋白質(zhì)的破壞且有效縮短提取時間[7]。本實驗采用雙向凝膠電泳技術(shù)來分離并檢測提取出的蛋白，該技術(shù)也在其他領(lǐng)域中廣泛使用[8,13]。凝膠色譜法作為雙向電泳技術(shù)的基本方法，在實驗中發(fā)揮重要作用。蛋白分離和解析所使用的凝膠色譜法獲得的蛋白圖譜具有高分辨度[9]，可高效地對蛋白質(zhì)進行識別和分析。最后，通過現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)可得出所提取的海南樂東產(chǎn)紅心火龍果的蛋白指紋圖譜。生物質(zhì)譜技術(shù)是一種新興技術(shù)，它將現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)與生物化學(xué)的分析方法相結(jié)合，利用分子在有機體內(nèi)的動態(tài)分布規(guī)律、通過質(zhì)譜技術(shù)對其動態(tài)分布進行解析處理，從而對蛋白質(zhì)定性、定量[11]。該技術(shù)還可分析生物體代謝途徑中的核酸、脂類、蛋白質(zhì)等各個階段生物大分子[12]。本論文的研究選取海南樂東產(chǎn)紅心火龍果作為研究對象，通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，依次對海南樂東產(chǎn)紅心火龍果進行蛋白提取、蛋白分離并利用MOLDI-TOF-MAS對所獲得的海南樂東產(chǎn)紅心火龍果蛋白進行相關(guān)鑒定。最后，通過搜庫比對分析并確定蛋白名稱及其種類。2實驗部分2.1實驗材料、試劑及儀器2.1.1實驗藥材及制備本實驗挑選海南省樂東縣（于北緯18°24′至18°58′，東經(jīng)108°39′至109°24′之間）果實正常發(fā)育且形態(tài)良好,表面無外傷以及病蟲害侵染且成熟期的紅心火龍果為實驗樣品，將樣品紅心火龍果切碎置研缽中，根據(jù)樣品重量加入1%PVPP和1%二氧化硅進行研磨，研磨過程中不斷加入液氮保持其低溫環(huán)境。待樣品研磨至粉末狀之后，將其置于-80°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?.1.2試劑表SEQ表\*ARABIC1主要試劑試劑名稱純度品牌尿素（Urea）AR上海BBI生命科學(xué)苯甲基磺酰氟（PMSF）AR上海BBI生命科學(xué)硫脲（Thiourea）BR廣東西隴科學(xué)3-［3-(膽酰胺丙基)二甲氨基］丙磺內(nèi)鹽(CHAPS)AR北京索萊寶二硫蘇糖醇（DTT）BR北京索萊寶碘乙酰胺（IAM）AR上海麥克林過硫酸銨AR上海麥克林三(羥甲基)氨基甲烷（Tris）BR北京索萊寶5×上樣緩沖液(5×Loadingbuffer)/北京索萊寶丙烯酰胺BR上海麥克林十二烷基磺酸鈉（SDS）AR上海BBI生命科學(xué)甘氨酸（GLycine）BR北京索萊寶抗壞血酸BR上海BBI生命科學(xué)交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮（PVPP）BR上海生工二氧化硅AR上海滬試硼酸鈉十水AR上海生工EDTA二鈉鹽AR上海生工甲叉雙丙烯酰胺AR上海麥克林四甲基乙二胺（TEMED）BR北京索萊寶考馬斯藍G-250AR上海BBI生命科學(xué)1%溴酚藍/上海BBI生命科學(xué)牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（BSA）BR上海BBI生命科學(xué)瓊脂糖BR山東西亞硫酸銨AR上海生工蔗糖AR廣東西隴科學(xué)碳酸氫銨AR上海滬試丙三醇AR上海滬試吐溫-20AR北京索萊寶曲拉同X-100AR北京索萊寶正丁醇AR廣東西隴科學(xué)異丙醇AR廣東西隴科學(xué)液體石蠟AR廣東西隴科學(xué)無水甲醇AR廣東西隴科學(xué)無水乙醇AR廣東西隴科學(xué)乙酸AR廣東西隴科學(xué)85%磷酸AR廣東西隴科學(xué)β-巰基乙醇AR廣東西隴科學(xué)IMMDrystrippH4-7/美國GEIPGBufferpH3-10/美國GE2.1.3儀器表SEQ表\*ARABIC2主要儀器和設(shè)備儀器名稱品牌SE600Ruby垂直電泳儀美國GEEttanTMDALTsix電泳槽美國GEMμLtiTempIV水浴恒溫循環(huán)器美國GEEttanIPGphor3等電聚焦儀美國GEImageScannerⅢ掃描儀美國GEUltraflextremeMOLDI-TOF-MAS質(zhì)譜儀德國BRUKERSIGMA3-18K超高速離心機德國SIGMASmart-S超純水儀中國上海和泰EYELA振蕩器日本東京理化FDU-2110凍結(jié)干燥機日本東京理化HH-G1數(shù)顯恒溫水浴鍋中國常州普天儀器制造有限公司PHSJ-3FpH計中國上海儀電TP-214分析天平美國丹佛T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計中國北京普析通用儀器有限責(zé)任公司KQ2200E超聲波清潔器中國曙峰企業(yè)2.1.4主要溶液配制表SEQ表\*ARABIC3主要溶液配制試劑名稱配置方法BPP蛋白提取液TRIS-base

12.1g，EDTA

二鈉37.3g，十水硼酸鈉19.1g，加500mL超純水溶解完全。加入8.8g抗壞血酸，300g蔗糖，β

-巰基乙醇20mL和10

mLTriton

X-100

，用Tris-base調(diào)節(jié)pH至8.0后加水定容到1000mL。AM沉淀劑1000mL甲醇中溶解30g

硫酸銨。Lysis

Buffer蛋白質(zhì)裂解液8.4g尿素(Urea)

，3.06g硫脲(Thiourea)以及0.4gCHAPS，超純水定容至10mL。使用前分別加入DTT及PMSF，兩種溶液最終濃度為:10μL/mL

PMSF

和10mg/mLDTT。10%過硫酸銨(AP)稱取1g過硫酸銨，用超純水定容至10mL。5%濃縮膠量取30%Acr溶液1.7mL，1.5MpH=6.8的Tris緩沖液1.25mL，超純水6.85mL，10%SDS溶液0.1mL，10%過硫酸銨溶液0.1mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。最后加入0.01mL的TEMED。30%丙烯酰胺(Acr)取適量超純水加熱溶解8g甲叉二丙烯酰胺，再取適量超純水溶解300g丙烯酰胺。將兩份液體合并，超純水定容至1000mL。10%分離膠量取30%Acr溶液10mL，1.5MpH=8.8的Tris緩沖液7.5mL，超純水11.9mL，10%SDS溶液0.3mL，10%過硫酸銨溶液0.3mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。最后加入0.012mL的TEMED溶液。10電極緩沖液稱取Tris30.3g，Gly144g，SDS10g，用超純水定容至1000mL。Bradford溶液稱取100mg的CBB

G250

溶于50mL5%乙醇中，加入85％磷酸100mL，定容至1L，過濾，在4℃環(huán)境中貯存。4分離膠貯存液800mL超純水溶解181.7gTris堿，HCL調(diào)節(jié)pH至8.8后定容至1000mL。12.5%分離膠量取31.8mL超純水，25mL4分離膠貯存液，41.7mL30%丙烯酰胺，1mL10%SDS，500μL10%AP，33μLTEMED?，F(xiàn)用現(xiàn)配，TEMED以及AP

配制最后加入。溴酚藍1%100mL超純水中溶解1g溴酚藍和0.6gTris。1%瓊脂糖封膠液取瓊脂糖0.5g和200μL1%

溴酚藍于100mL1電泳液中加熱溶解。平衡緩沖液1.5mol/LpH=8.8的Tris-HCl25mL，180.2g尿素，150mL甘油，10gSDS，1%溴酚藍1mL，超純水定容至500mL，-20℃環(huán)境下保存。其中，DTT（1%）與IAM（2.5%）于使用前加入。2倍考染液(CBB-A)稱取1.25gG250，再依次加入100mL超純水，300mL無水乙醇和100mL無水甲醇，放置于37℃，r=150rpm的恒溫搖床上搖晃1h。考染液CBB-B（避光）稱取100g硫酸銨

，用300mL超純水充分溶解后再加入59mL85%磷酸,定容至500mL。注意：CBB-A搖晃1h之后，再配制CBB-B。凝膠染色時等體積混合CBB-A和CBB-B。凝膠脫色液量取300mL無水乙醇、50mL無水乙酸，混合后超純水定容至1L。膠粒脫色液100％乙腈50mL和100mmol/L碳酸氫銨50mL混合均勻?；|(zhì)溶液取7ml乙腈+3ml超純水+3μLTFA混合均勻后加0.004mgHCCA。2.2實驗操作2.2.1海南紅心火龍果蛋白的提取稱取適量（約100g）海南樂東產(chǎn)紅心火龍果肉，分批適量置于預(yù)冷研缽中，為防止樣品氧化，需根據(jù)每份樣品的質(zhì)量，加入1%PVPP和1%二氧化硅進行研磨，研磨過程中不斷加入液氮保持其低溫環(huán)境。將樣品研磨至粉末狀即可。每3g研磨之后的海南樂東產(chǎn)紅心火龍果粉末需加入預(yù)冷10mLBPP提取緩沖液，室溫渦旋振蕩10分鐘。之后再加入10mL的Tris飽和酚，再次于室溫下渦旋振蕩10分鐘。設(shè)置離心機參數(shù)為4°C，16000rpm，離心15分鐘，收集離心之后上清液。將上清液與BPP緩沖溶液按照1：2比例混合室溫渦旋振蕩10分鐘。保持離心機參數(shù)不變，離心15分鐘，收集上清液。將預(yù)冷的過飽和硫酸銨甲醇溶液和上清液按照3：1的比例混合，在-20°C條件下過夜沉淀。第二日，可見明顯沉淀物。設(shè)置離心機參數(shù)為4°C，16000rpm，在該條件下離心15分鐘，移去上清液。每管中加入1ml冰冷甲醇，將充分充分打碎后的沉淀物混合，保持離心機參數(shù)不變離心5分鐘，移去上清液，重復(fù)此步驟2次。再向其中加入0.5ml冰冷丙酮[7，14]，將蛋白塊盡量攪碎，保持離心機參數(shù)不變，離心5分鐘，棄上清，重復(fù)2次。室溫風(fēng)干蛋白沉淀，加適量蛋白裂解液，蛋白沉淀22°C溶解4-5個小時。20°C，18000rpm的條件下將溶解完全的蛋白液離心30分鐘，轉(zhuǎn)移蛋白溶液，放置于冰箱下層，-20℃保存。2.2.2蛋白質(zhì)的定量配制梯度濃度分別為0、2、4、6、8、10μg/ml的牛血清蛋白儲備液。根據(jù)Bradford法[16]，在595nm處用紫外分光光度法測定吸收值，做標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。取3μL待測海南樂東產(chǎn)紅心火龍果蛋白樣品測定紫外吸光度值，重復(fù)三次，取平均值。根據(jù)實驗結(jié)果測得蛋白濃度，以便進行后續(xù)電泳實驗。2.2.3單向聚丙烯酰胺凝膠電泳組裝配件，灌注10%分離膠至合適體積，用1mL正丁醇壓膠，靜置過夜。次日上午，倒掉正丁醇，灌注5%濃縮膠至溢出，快速插入梳子，靜置1小時以上。拔出梳子后，加入1×電泳緩沖液。上樣前將5xloadingbuffer和蛋白樣品按照4:1比例混合水浴煮沸5分鐘。每孔中依次加入稀釋后的樣品（2ug/uL），對照品與實驗品的濃度梯度需一致（20ul40ul60ul80ul），樣品泳道一側(cè)加入彩虹marker5uL，然后在兩側(cè)各加入10uL5xloadingbuffer。電源設(shè)置5w/片，開始進行蛋白濃縮，約1小時。待樣品至上下膠分界線之后，電源設(shè)置7w/片，開始進行蛋白分離至結(jié)束。凝膠室溫下染色搖床過夜。染色完成后，重復(fù)3次脫色，每次40分鐘。脫色完成后，將凝膠轉(zhuǎn)移1L7%乙酸（凝膠保存液）中放置1小時左右，重復(fù)兩次至背景干凈。使用ImageScannerIII掃描儀掃描脫色完成后的單向凝膠圖譜，將獲得的圖像保存?zhèn)溆谩?.2.4雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳水化上樣和第一向等點聚焦（IEF）在一次性水化盤內(nèi)采用膠內(nèi)水化的方式上樣，上樣前要提前半小時從冰箱中拿出四張NLpH4~7的24cmIPG膠條。每條水化槽道中加445μL蛋白樣品＋蛋白裂解液和5μLIPGbuffer后，再緩慢覆蓋住NLpH4~7的24cmIPG膠條，再加入5ml液體石蠟鋪滿水化槽道，覆蓋住膠條。450μL上樣體積中蛋白量應(yīng)為1.3mg。20°C恒溫水化18h。水化結(jié)束后，開始等電聚焦。聚焦極限電流為50μA/膠條，聚焦環(huán)境溫度為20°C。具體參數(shù)如下：StepUVTIME12503h25002h310003h430002h5800014h610001h膠條平衡等點聚焦結(jié)束后，膠條依次在DTT和碘乙酰胺兩種平衡緩沖液中進行平衡，每次15分鐘，各平衡兩次。SDS（雙向垂直電泳）使用12.5%分離膠進行雙向垂直電泳。仔細將平衡后膠條轉(zhuǎn)移至雙向垂直板膠的上端，用瓊脂糖封膠以便固定住膠條。在雙向電泳儀中加1x電泳緩沖液。設(shè)置電泳參數(shù)設(shè)置為1W/gel，循環(huán)水浴溫度為16°C，1小時后改變電泳參數(shù)為13W/gel至電泳結(jié)束。凝膠染色和脫色電泳結(jié)束之后，將凝膠室溫染色搖床過夜。之后，脫色液脫色40分鐘，重復(fù)三次。最后將凝膠轉(zhuǎn)移至保存液中1小時。凝膠掃描和圖像分析掃描雙向凝膠圖譜。300dpi投射掃描，用ImageMaster5.0圖像分析軟件對圖像進行分析，查找差異蛋白點。膠內(nèi)酶解參照凝膠分析的結(jié)果找出四張凝膠上各個蛋白點的相對位置，修剪槍頭至適配各蛋白點的大小進行挖點，將多次挖點后的蛋白點匯總至新的離心管中，每個蛋白點都需要更換新的離心管和槍頭。將挖點之后的凝膠圖打印保存。在離心管上寫好標(biāo)簽，于-86°C冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.5質(zhì)譜鑒定膠粒脫色之后再進行酶解。膠粒脫色的具體步驟如下：在盛有蛋白點的離心管中加入150μL超純水，設(shè)置搖床參數(shù)為150rpm，震蕩30分鐘。震蕩結(jié)束后，直接吸去超純水并再加入150μL超純水按照上述參數(shù)震蕩，重復(fù)三次。之后，將較大的凝膠顆粒搗碎至米粒大小，加入200μL膠粒脫色液，設(shè)置搖床參數(shù)為150rpm，震蕩30分鐘。同樣重復(fù)以上操作3次，直至膠粒變?yōu)闊o色透明狀。再加入200μL超純水，搖床150rpm震蕩10分鐘，重復(fù)三次，該過程是為去除樣品中的NH4HCO3，否則質(zhì)譜鑒定結(jié)果可能會受到殘留的鹽離子的影響。膠粒在200uL100%ACN中脫色15分鐘，重復(fù)上述操作直至膠粒變?yōu)橛驳摹⒓儼咨w粒。最后一次操作時直接吸去ACN，將離心管封口，在-86°C冰箱保存?zhèn)溆?。酶解。向膠粒中加入恰好漫過其的胰蛋白酶，之后在4°C條件下放置60分鐘，再加入略微超出膠粒的酶解液，將其放置于搖床上，37°C酶解蛋白13小時。將酶解后膠粒常溫離心10分鐘，收集酶解液用于質(zhì)譜鑒定。在離心管上做好標(biāo)記并放置于-20℃的冰箱中保存。點樣（三步法）：首先取1μL基質(zhì)液于點樣板上，晾干；然后取3μL樣品酶解液于點樣板上等待其晾干；最后再在晾干的樣品上點取1μL基質(zhì)液，靜待其陰干。點樣結(jié)束后，采用MOLDI-TOF-MAS對海南樂東產(chǎn)紅心火龍果樣品中的蛋白進行質(zhì)譜鑒定。測試前需進行校正。通過BioTool軟件將所獲得的海南樂東產(chǎn)紅心火龍果蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行分析，將肽質(zhì)量指紋譜數(shù)據(jù)提交到蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進行搜庫比對，以便確定海南樂東產(chǎn)紅心火龍果中蛋白的生物分類、名稱、相對分子質(zhì)量、得分、等電點以及覆蓋率等相關(guān)信息。3結(jié)果與討論3.1蛋白質(zhì)定量分析利用Bradford法[15]對海南火龍果中的蛋白質(zhì)進行定量檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中縱坐標(biāo)為對應(yīng)的吸光度，橫坐標(biāo)為BSA的濃度。見圖1，曲線方程為y=0.83462+0.14443x，R2為0.99407，符合測定要求。得出海南樂東產(chǎn)紅心火龍果樣品中的平均蛋白濃度為12.765μg/mL。圖SEQ圖\*ARABIC1牛血清標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線3.2單向凝膠電泳分析圖SEQ圖\*ARABIC2海南火龍果單向電泳圖判斷所提取的海南樂東產(chǎn)紅心火龍果中蛋白質(zhì)是否降解或者變性可以通過單向凝膠電泳來檢測。單向電泳圖中結(jié)果顯示，蛋白條帶隨著上樣量的遞增，愈發(fā)豐富、明顯；樣品蛋白條帶數(shù)量多且清晰。由此推斷所提取的海南樂東產(chǎn)紅心火龍果蛋白沒有變性且未降解，其所含的高豐度蛋白較少，可開展進一步實驗。由海南火龍果單向電泳圖可得該樣品火龍果蛋白的分子量在33kDa左右主要集中。3.3雙向凝膠電泳分析本試驗選用固相pH膠條（IPG，24cm，pH=4~7），利用優(yōu)化后的BPP+酚抽提法去除植物的高豐度蛋白，除去多種雜質(zhì)[17]，獲得海南樂東產(chǎn)紅心火龍果的蛋白指紋圖譜（圖3）。其中高表達蛋白點為78個,編號已在圖A中標(biāo)出。圖SEQ圖\*ARABIC3海南火龍果果2-DE電泳圖譜（A圖已標(biāo)記，B、C、D均為重復(fù)結(jié)果）3.4生物質(zhì)譜搜庫分析將所得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過BRUKER儀器專用軟件FlexAnalysis及Biotool軟件分析，最后將一級與二級肽質(zhì)譜數(shù)據(jù)提交到數(shù)據(jù)庫中搜庫比對，得到蛋白質(zhì)的名稱和種類[16]，見表4?？纱_定海南樂東產(chǎn)紅心火龍果蛋白47個，其來源真菌、植物、其他生物和細菌四個不同的種類。表SEQ表\*ARABIC4海南火龍果蛋白鑒定結(jié)果匯總蛋白編號Proteinnumber蛋白質(zhì)名稱Proteinname相對分子質(zhì)量Monoisotopicmass等電點PI得分Score覆蓋率（%）Coverage（%）NCBI生物分類Taxonomy1主要過敏原I多肽鏈2MajorallergenIpolypeptidechain2120174.821116貓頭鷹Feliscatus2核帽結(jié)合蛋白亞基2Nuclearcap-bindingproteinsubunit2210138.871910裂殖酵母pombe972h-Schizosaccharomycespombe972h3感覺視紫紅質(zhì)IIISensoryrhodopsinIII250689.6578HaloarculamarismortuiATCC430494VpX5'區(qū)中未表征的蛋白質(zhì)UncharacterizedproteininVpX5'region(Fragment)53089.821843乳酸脫氫酶升高病毒Lactatedehydrogenase-elevatingvirus6肌紅蛋白Myoglobin154438.702235鰹魚Katsuwonuspelamis7腺苷鈷酰胺-GDP利巴唑轉(zhuǎn)移酶Adenosylcobinamide-GDPribazoletransferase264339.261921富馬氧化物同旋桿菌SyntrophobacterfumaroxidansMPOB8NADH-醌氧化還原酶亞基KNADH-quinoneoxidoreductasesubunitK110796.542526富營養(yǎng)亞硝化單胞菌C91NitrosomonaseutrophaC919Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑superbin-2Kunitz-typeserineproteaseinhibitorsuperbin-295228.252660銅班蛇Austrelapssuperbus10光系統(tǒng)I反應(yīng)中心亞基XIIPhotosystemIreactioncentersubunitXII34004.541978球毛球藻Chaetosphaeridiumglobosum11推定金屬硫蛋白MT1DPPutativemetallothioneinMT1DP58348.372640人Homosapiens13減數(shù)分裂抑制劑蛋白1Meiosisinhibitorprotein11428956.24101人Homosapiens14ATP合酶ε鏈ATPsynthaseepsilonchain148574.852821牡蠣希瓦氏菌ATCC700345ShewanellapealeanaATCC70034516芋螺毒素VnMSGL-0122ConotoxinVnMSGL-012290258.293940地中海芋螺Conusventricosus19脂蛋白信號肽酶Lipoproteinsignalpeptidase189808.073639生防假單胞菌Pf-5PseudomonasprotegensPf-520乙酰輔酶A羧化酶羧基轉(zhuǎn)移酶亞基αAcetyl-coenzymeAcarboxylasecarboxyltransferasesubunitalpha353495.762825志賀氏菌CDC3083-94ShigellaboydiiCDC3083-9423Na（+）-易位NADH-醌還原酶亞基DNa(+)-translocatingNADH-quinonereductasesubunitD227518.952735坎貝爾弧菌BAA-1116型VibriocampbelliiATCCBAA-111626自噬相關(guān)蛋白2Autophagy-relatedprotein22129605.2971新型隱球菌變種B-3501ACryptococcusneoformansvar.neoformansB-3501A27轉(zhuǎn)錄因子JUNGBRUNNEN1TranscriptionfactorJUNGBRUNNEN1316658.24246擬南芥Arabidopsisthaliana28伴侶蛋白GroEL60kDachaperonin575075.0983日光細菌HeliobacteriummodesticaldumIce129金屬硫蛋白Metallothionein75978.382657綠頭鴨Anasplatyrhynchos30金屬硫蛋白Metallothionein71718.051930北方須鰍Barbatulabarbatula33ATP磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶ATPphosphoribosyltransferase238436.981111新鞘鯛NovosphingobiumaromaticivoransDSM1244434光系統(tǒng)II反應(yīng)中心蛋白YPhotosystemIIproteinY387911.723371顆石藻Emilianiahuxleyi36未表征蛋白YitQUncharacterizedproteinYitQ220398.64511枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌亞種subtilisstr.168Bacillussubtilissubsp.subtilisstr.16838乙酸激酶Acetatekinase437686.123322擬桿菌thetaiotaomicronVPI-5482BacteroidesthetaiotaomicronVPI-548241金屬硫蛋白-1EMetallothionein-1E71508.382044人Homosapiens42金屬硫蛋白-1AMetallothionein-1A72398.383352穴兔Oryctolaguscuniculus43小核糖體亞基蛋白bS2030SribosomalproteinS20946611.182031嗜冷黃桿菌JIP02/86FlavobacteriumpsychrophilumJIP02/8645ATP合酶蛋白8ATPsynthaseprotein865846.703650斑馬魚Daniorerio46ATP合酶蛋白8ATPsynthaseprotein865846.703650斑馬魚Daniorerio47DNA定向RNA聚合酶亞基Rpo12DNA-directedRNApolymerasesubunitP52889.341223古菌DSM4304ArchaeoglobusfulgidusDSM43044945kDa細胞壁蛋白45kDacellwallprotein(Fragment)16348.591480菜豆Phaseolusvulgaris5145kDa細胞壁蛋白45kDacellwallprotein(Fragment)16348.591480菜豆Phaseolusvulgaris53核糖體RNA小亞基甲基轉(zhuǎn)移酶HRibosomalRNAsmallsubunitmethyltransferaseH353035.76134嗜堿菌OhILAsAlkaliphilusoremlandiiOhILAs54細胞分裂拓撲特異性因子Celldivisiontopologicalspecificityfactor115409.611720核梭桿菌核亞種ATCC25586Fusobacteriumnucleatumsubsp.nucleatumATCC2558655鉀通道毒素α-KTx14.1Potassiumchanneltoxinalpha-KTx14.161718.583018馬氏正鉗蝎Mesobuthusmartensii58鳥苷酸激酶Guanylatekinase233285.1475GeobactersulfurreducensPCA59堿性磷脂酶A2BasicphospholipaseA2APL-D49165758.613533食魚蝮Agkistrodonpiscivorusleucostoma60大核糖體亞基蛋白uL29c50SribosomalproteinL29,chloroplastic79379.741316細基江蘺繁枝變種Gracilariatenuistipitatavar.liui62大核糖體亞基蛋白uL1150SribosomalproteinL11147119.302824海洋原綠球菌NATL1AProchlorococcusmarinusstr.NATL1A63未表征蛋白MJ0766UncharacterizedproteinMJ076674589.271828詹氏甲烷球菌MethanocaldococcusjannaschiiDSM266165乳清酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶Orotatephosphoribosyltransferase209795.673120ChlorobiumphaeovibrioidesDSM26568天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶，細胞質(zhì)Aspartateaminotransferase,cytoplasmic462578.4672 釀酒酵母S288cSaccharomycescerevisiaeS288C74大核糖體亞基蛋白uL250SribosomalproteinL23042410.6266海桿菌HTE831型OceanobacillusiheyensisHTE83175Coldshockdomain-containingprotein4194086.292218擬南芥Arabidopsisthaliana76金屬硫蛋白Metallothionein71618.383255弓頭鯨Balaenamysticetus77甲基-5'-硫代腺苷磷酸化酶S-methyl-5'-thioadenosinephosphorylase313236.31237玻璃海鞘Cionaintestinalis3.5海南火龍果蛋白的功能分析對海南火龍果的蛋白進行分析鑒定后，利用生物信息學(xué)的方法，分析了海南火龍果蛋白的功能，結(jié)果如表4所示。從表4可看出，在海南火龍果蛋白中，2號蛋白參與了核mRNA的成熟、輸出和降解；6號蛋白可以儲存氧氣并促進其擴散還可以保護細胞免受活性氧的侵害；9號蛋白是絲氨酸蛋白酶的抑制劑；11、29、30、41、42號蛋白含有高含量的半胱氨酸殘基，可以結(jié)合各種重金屬；13號蛋白為正常減數(shù)分裂染色體突觸所必須的蛋白；19、34、45、46號蛋白均可參與產(chǎn)生ATP；26號蛋白在細胞膜的擴增中發(fā)揮了一定作用；28號蛋白在協(xié)助蛋白質(zhì)折疊方面起到了至關(guān)重要的作用；33號蛋白在催化ATP等途徑中同樣起到了至關(guān)重要的作用；38號蛋白具有多種催化能力；54號蛋白參與了細胞的分裂；55號蛋白是鉀通道的潛在阻斷劑；58號蛋白則對于回收GMP以及間接回收cGMP至關(guān)重要；68號蛋白在氨基酸代謝中起關(guān)鍵作用。其中ATP合酶蛋白（45、46號）主要涉及火龍果的生長、發(fā)育等多種功能。表SEQ表\*ARABIC5海南火龍果蛋白功能分析蛋白編號Proteinnumber蛋白質(zhì)名稱Proteinname生物學(xué)功能Biologicalfunction2核帽結(jié)合蛋白亞基2Nuclearcap-bindingproteinsubunit2CBC復(fù)合物的組分，其與前mRNA的5'帽共轉(zhuǎn)錄結(jié)合，并參與核mRNA的成熟、輸出和降解[17]。3感覺視紫紅質(zhì)IIISensoryrhodopsinIII感覺視紫紅質(zhì)。與一種不尋常的換能器相關(guān)聯(lián)，該換能器缺乏在所有其他光感換能器中發(fā)現(xiàn)的甲基接受換能器結(jié)構(gòu)域[18]。6肌紅蛋白Myoglobin單體血紅素蛋白，其主要功能是儲存氧氣并促進其在肌肉組織內(nèi)的擴散。通過五配位的血紅素鐵可逆地結(jié)合氧氣，并在需求增加期間根據(jù)需要及時有效地釋放氧氣。根據(jù)組織和細胞的氧化條件，除了結(jié)合氧氣的能力外，它還具有亞硝酸鹽還原酶活性，從而調(diào)節(jié)生物活性一氧化氮的產(chǎn)生。在缺氧和缺氧等應(yīng)激條件下，由于其假過氧化物酶活性，它還可以保護細胞免受活性氧的侵害[19]。7腺苷鈷酰胺-GDP利巴唑轉(zhuǎn)移酶Adenosylcobinamide-GDPribazoletransferase加入腺苷鈷酰胺-GDP和α-利巴唑生成腺苷鈷胺素（Ado-cobalamin）。還從腺苷鈷酰胺-GDP和α-核唑5'-磷酸合成腺苷鈷胺素5'-磷酸[20]。8NADH-醌氧化還原酶亞基KNADH-quinoneoxidoreductasesubunitK此蛋白可電子從NADH中轉(zhuǎn)移到呼吸鏈中的醌。還可將氧化還原反應(yīng)與質(zhì)子易位偶聯(lián)，并因此在質(zhì)子梯度中保守氧化還原能量[21]。9Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑superbin-2Kunitz-typeserineproteaseinhibitorsuperbin-2絲氨酸蛋白酶抑制劑。13減數(shù)分裂抑制劑蛋白1Meiosisinhibitorprotein1正常減數(shù)分裂染色體突觸所必需?？赡軈⑴c精母細胞減數(shù)分裂雙鏈斷裂（DSB）的形成（通過相似性）[22]。14ATP合酶ε鏈ATPsynthaseepsilonchain在膜上存在質(zhì)子梯度的情況下從ADP產(chǎn)生ATP[23]。19脂蛋白信號肽酶Lipoproteinsignalpeptidase這種蛋白質(zhì)特異性催化從原脂蛋白中去除信號肽[24]。20乙酰輔酶A羧化酶羧基轉(zhuǎn)移酶亞基αAcetyl-coenzymeAcarboxylasecarboxyltransferasesubunitalpha乙酰輔酶A羧化酶（ACC）復(fù)合物的組分。生物素羧化酶催化生物素首先在其BCCP上進行羧化，然后CO2基團被羧基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移到乙酰輔酶A，由此形成丙二酰輔酶A[25]。23Na（+）-易位NADH-醌還原酶亞基DNa(+)-translocatingNADH-quinonereductasesubunitDNQR復(fù)合物通過兩個連續(xù)的反應(yīng)催化泛醌-1還原為泛醇，同時將Na離子從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到周質(zhì)。NqrA到NqrE可能涉及第二步，即泛西醌轉(zhuǎn)化為泛醇[26]。26自噬相關(guān)蛋白2Autophagy-relatedprotein2自噬體完成和過氧化物酶體降解所需的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白。將分離膜（IM）的邊緣拴在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）上，并介導(dǎo)脂質(zhì)從ER到IM的直接轉(zhuǎn)移以進行IM擴增。ATG2與其N端區(qū)域（NR）中的堿性殘基結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出口位點（ERES），后者是自噬體形成的膜源，并通過其C端區(qū)域與IM的擴展邊緣結(jié)合。后者的結(jié)合由ATG18-PtdIns3P相互作用輔助。然后，ATG2使用其NR從膜源中提取磷脂，并通過其預(yù)測的富含β折疊的結(jié)構(gòu)將它們轉(zhuǎn)移到ATG9到IM，用于膜擴增[27]。28伴侶蛋白GroEL60kDachaperonin與其共伴侶蛋白GroES一起，在協(xié)助蛋白質(zhì)折疊方面起著至關(guān)重要的作用。GroEL-GroES系統(tǒng)形成一個納米籠，允許封裝非天然底物蛋白，并提供優(yōu)化的物理環(huán)境，以促進和加速蛋白質(zhì)折疊[28]。29，30，41，42，76金屬硫蛋白Metallothionein金屬硫蛋白含有高含量的半胱氨酸殘基，可結(jié)合各種重金屬[29]。33ATP磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶ATPphosphoribosyltransferase催化ATP和5-磷酸核糖1-二磷酸縮合形成N'-（5'-磷酸核糖基）-ATP（PR-ATP）。在該途徑中起著至關(guān)重要的作用，因為組氨酸生物合成的速率似乎主要由調(diào)節(jié)HisG酶活性來控制[30]。34光系統(tǒng)II反應(yīng)中心蛋白YPhotosystemIIproteinY它是光系統(tǒng)II（PSII）核心的松散結(jié)合成分，并不總是在晶體中看到。PSII是一種光驅(qū)動的水質(zhì)體醌氧化還原酶，利用光能從H中提取電子2O，產(chǎn)生質(zhì)子梯度，隨后用于ATP的形成[31]。38乙酸激酶Acetatekinase催化乙酸酯和ATP形成乙酰磷酸酯。還能催化逆反應(yīng)[32]。43小核糖體亞基蛋白bS2030SribosomalproteinS20直接與16S核糖體RNA結(jié)合[33]。45，46ATP合酶蛋白8ATPsynthaseprotein8線粒體膜ATP合成酶，在膜上質(zhì)子梯度存在的情況下由ADP生成ATPF型ATP酶由膜質(zhì)子通道組成。在催化過程中，在F的催化域中合成ATP1通過中央莖亞基的旋轉(zhuǎn)機制與質(zhì)子易位耦合。[34]。47DNA定向RNA聚合酶亞基Rpo12DNA-directedRNApolymerasesubunitPDNA依賴性RNA聚合酶（RNAP）催化DNA轉(zhuǎn)錄為RNA[35]。53核糖體RNA小亞基甲基轉(zhuǎn)移酶HRibosomalRNAsmallsubunitmethyltransferaseH特異性甲基化胞苷在16SrRNA的1402（C1402）位的N4位[36]。54細胞分裂拓撲特異性因子Celldivisiontopologicalspecificityfactor防止蛋白質(zhì)MinC和MinD在內(nèi)部分裂位點抑制細胞分裂，同時允許在極性位點進行抑制。這通過限制在細胞長軸中點形成分裂隔膜來確保細胞在適當(dāng)?shù)牟课环至裑37]。55鉀通道毒素α-KTx14.1Potassiumchanneltoxinalpha-KTx14.1鉀通道的潛在阻斷劑[38]。58鳥苷酸激酶Guanylatekinase對于回收GMP和間接回收cGMP至關(guān)重要[39]。59堿性磷脂酶A2BasicphospholipaseA2APL-D49PLA2催化3-sn-磷酸甘油酯中2-?；拟}依賴性水解。在肌肉注射小鼠模型中誘導(dǎo)局部和全身肌毒性。在小鼠腳墊測定中誘導(dǎo)局部水腫。不具有任何抗凝作用。不介導(dǎo)對革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌的抗菌作用[40]。62大核糖體亞基蛋白uL1150SribosomalproteinL11形成核糖體柄的一部分，幫助核糖體與GTP結(jié)合的翻譯因子相互作用[41]。65乳清酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶Orotatephosphoribosyltransferase催化核糖基磷酸基團從5-磷酸核糖1-二磷酸轉(zhuǎn)移到乳清酸，導(dǎo)致奧羅替丁一磷酸（OMP）的形成[42]。68天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶，細胞質(zhì)Aspartateaminotransferase,cytoplasmic在氨基酸代謝中起關(guān)鍵作用[43]。74大核糖體亞基蛋白uL250SribosomalproteinL2主要的rRNA結(jié)合蛋白之一。需要30S和50S亞基結(jié)合以形成70S核糖體，用于tRNA結(jié)合和肽鍵形成。有人認為它具有肽基轉(zhuǎn)移酶活性;這有點爭議。與16S核糖體中的70SrRNA進行多次接觸[44]。75Coldshockdomain-containingprotein4與RNA、單鏈（ssDNA）和雙鏈（dsDNA）DNA結(jié)合并解開核酸雙鏈體的伴侶。表現(xiàn)出DNA熔解活性?？赡苌婕澳秃浴７乐狗N子在脫水或鹽脅迫條件下發(fā)芽[45]。77甲基-5'-硫代腺苷磷酸化酶S-methyl-5'-thioadenosinephosphorylase催化S-甲基-5'-硫代腺苷（MTA）可逆磷酸化為腺嘌呤和5-甲基硫代核糖-1-磷酸。參與MTA的分解，MTA是多胺生物合成的主要副產(chǎn)物。負責(zé)從S-腺苷甲硫氨酸產(chǎn)生MTA后蛋氨酸挽救途徑的第一步。以6-氨基嘌呤核苷為首選底物，具有廣泛的底物特異性[46]。4結(jié)論本研究通過BPP+酚抽提法、雙向凝膠電泳以及生物質(zhì)譜鑒定等方法提取并鑒定海南樂東產(chǎn)紅心火龍果中的植物蛋白，得出以下結(jié)論：海南樂東產(chǎn)紅心火龍果蛋白的分子量在33KD左右主要集中，生物質(zhì)譜鑒定出有47個蛋白，涉及火龍果的生長、發(fā)育、代謝、增殖和抗逆等多種生理功能。本研究所得火龍果蛋白種類可以為深入開發(fā)和利用海南火龍果提供理論依據(jù)，同時對研究其他海南熱帶水果的研究和發(fā)展也具有一定的指導(dǎo)意義。

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