(高清版)DB32∕T 2583-2013 飼料中飼用芽孢桿菌的測定

飼料中飼用芽孢桿菌的測定2013-12-20發(fā)布2014-01-20實(shí)施DB32/T2583-2013本標(biāo)準(zhǔn)編寫按GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》的規(guī)定。本標(biāo)準(zhǔn)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出。本標(biāo)準(zhǔn)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所、江蘇省動物衛(wèi)生監(jiān)督所負(fù)責(zé)起草。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人為宦海琳、周維仁、閆俊書、白群安。1DB32/T2583-2013GB/T20195動物飼料試樣的制備GB/T4789.2-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定(原文中的參考文獻(xiàn))4原理25.4恒溫水浴鍋5.5恒溫培養(yǎng)箱5.6pH計(jì)(精確到±0.1個(gè)單位)或精密pH試紙1mL(具0.01刻度)、10mL(具0.1ml刻度)或微量移液器及吸頭。5.10滅菌玻璃珠5.11滅菌玻璃或塑料培養(yǎng)皿5.12玻璃涂布棒5.13光學(xué)顯微鏡6.10.85%滅菌生理鹽水6.2營養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基6.3革蘭氏染色液參見附錄中的A.2。6.4二乙酰(V-P)測定培養(yǎng)基和試劑參見附錄中的A.3。參見附錄中的A.4。參見附錄中的A.5。參見附錄中的A.6。參見附錄中的A.7。3參見附錄中的A.8。6.10硝酸鹽還原培養(yǎng)基和試劑參見附錄中的A.9。6.117%氯化鈉生長培養(yǎng)基參見附錄中的的A.10。6.12厭氧生長測定培養(yǎng)基參見附錄中的A.11。7檢樣的制備按照GB/T14699.1進(jìn)行采樣，采樣工具如鏟子、匙、采樣器、試管等，應(yīng)是無菌的。樣品送到微生物檢驗(yàn)室應(yīng)盡快檢驗(yàn)。按照GB/T20195進(jìn)行檢樣的制備，樣品制備后應(yīng)盡快檢驗(yàn)。8操作步驟8.1試樣稀釋8.1.1以無菌操作稱取試樣25g(mL),放于含有225mL0.85%滅菌生理鹽水的滅菌三角瓶中(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠),置振蕩器上振蕩30min,經(jīng)充分振搖后，制成1:10的均勻稀釋液。8.1.2用無菌吸管或微量移液器吸取1mL的1:10稀釋液，沿管壁慢慢注入含有9mL滅菌生理鹽水的試管中(注意吸管尖端不要觸及稀釋液),振搖試管，制成1:100的稀釋液。根據(jù)樣品含菌量，做進(jìn)一步的十倍系列遞增稀釋液。8.2接種和培養(yǎng)選擇2個(gè)-3個(gè)適宜的稀釋度，水浴80℃±1℃維持10min,每個(gè)稀釋度吸取0.1mL稀釋液接種到兩個(gè)營養(yǎng)瓊脂平板上，使用涂布棒進(jìn)行表面涂布。涂布好的平皿蓋好，置室溫中放置15min使接種物完全被瓊脂吸收。翻轉(zhuǎn)上述平皿置36℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h±2h。8.3芽孢桿菌計(jì)數(shù)用肉眼觀察，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位(colony-formingunits,CFU)表示。8.3.1選取菌落數(shù)在30CFU~300CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300CFU的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。8.3.2其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長時(shí)，則不宜采用；而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2,代表一個(gè)平板菌落數(shù)。9結(jié)果與報(bào)告9.1芽孢桿菌總數(shù)的計(jì)算方法9.1.1若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每g(mL)樣品中菌落總數(shù)結(jié)果。9.1.2若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，按公式(1)計(jì)算。4N——樣品中菌落數(shù)；∑C——平板(含適宜范圍菌落數(shù)的平板)菌落數(shù)之和；nl——第一稀釋度(低稀釋倍數(shù))平板個(gè)數(shù)；n2——第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))平板個(gè)數(shù)；d——稀釋因子(第一稀釋度)。示例：1:100000(第一稀釋度)1:1000000(第二稀釋度)菌落數(shù)(CFU)上述數(shù)據(jù)按9.2.2數(shù)字修約后，表示為25000000或2.5×10?。9.1.3若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300CFU,則對稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。9.1.4若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30CFU,則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。9.1.5若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。9.1.6若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30CFU~300CFU之間，其中一部分小于30CFU或大于300CFU時(shí)，則以最接近30CFU或300CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。9.2芽孢桿菌總數(shù)的報(bào)告9.2.1菌落數(shù)小于100CFU時(shí)，按“四舍五入”原則修約，以整數(shù)報(bào)告。9.2.2菌落數(shù)大于或等于100CFU時(shí)，第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。9.2.3稱重取樣以CFU/g為單位報(bào)告，體積取樣以CFU/mL為單位報(bào)告。10芽孢桿菌的鑒定(可選擇)目前商業(yè)上的生化鑒定試劑盒或生化鑒定管，如果采用的培養(yǎng)基與本標(biāo)準(zhǔn)鑒定試驗(yàn)所用的培養(yǎng)基一致，可以按照商品說明書使用這些試劑盒或生化鑒定管進(jìn)行菌種鑒定10.2純培養(yǎng)自平板上挑取5個(gè)菌落，分別劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，36℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h±2h,從每一平板上選取至少一個(gè)良好分離的特征菌落，轉(zhuǎn)接保存，進(jìn)行鑒定10.3形態(tài)觀察將挑選純化的菌落做革蘭氏染色鏡檢，飼用芽孢桿菌的菌落特征及染色鏡檢見表110.4生理生化鑒定將挑選純化的菌落進(jìn)行二乙酰(V-P)測定、糖發(fā)酵、明膠液化、丙酸鹽利用和7%氯化鈉生長試驗(yàn)。飼用芽孢桿菌的生理生化特征見表2。5DB32/T2583-2013菌種枯草芽孢桿菌(B.subulis)圓形或蔓延成波浪形、不規(guī)則性，灰白色或微黃色細(xì)胞為桿狀，有芽孢，芽孢橢圓形，中氏陽性明，扁平，邊緣不整齊呈毛發(fā)狀細(xì)胞為桿狀，單個(gè)、成對或短鏈排列，陽性凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)細(xì)胞為桿狀，單個(gè)、成對或短鏈排列，短小芽孢桿菌(B.pumilus)遲緩芽孢桿菌(B.lentus)細(xì)胞為桿狀，芽孢橢圓形，中生或近中側(cè)孢芽孢桿菌(B.laterosporus)細(xì)胞為桿狀，芽孢為橢圓形，側(cè)生、中—十+— ++++— 產(chǎn)酸++d++ ++d++十++d++ 水解明膠++ +d++++—+ +十d十 —十 十 硝酸鹽還原十十d—d++十+十 ++ +dd—++— 注：+表示90%以上菌株陽性；—表示90%以上菌株陰性；d表示11%-89%菌株為陽性；N1名稱蛋白胨牛肉膏氯化鈉A.2.1.1成分名稱結(jié)晶紫1%草酸銨水溶液碘碘化鉀A.2.2.2制法名稱2A.2.4.1將涂片在酒精燈火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染1min,水洗。A.2.4.2滴加革蘭氏碘液，作用1min,水洗。A.2.4.3滴加95%乙醇脫色，約15s~30s,直至染色液被洗掉，不要過分脫色，水洗。A.2.4.4滴加復(fù)染液，復(fù)染1min。水洗、待干、鏡檢。A.3V-P測定A.3.1度培養(yǎng)基A.3.1.1成分蛋白胨氯化鈉A.3.1.2制法A.3.2試劑A.3.3試驗(yàn)方法A.4芽孢桿菌糖發(fā)酵管A.4.1成分氯化鉀酵母膏A.4.2制法除指示劑溴甲酚紫外，其余各成分溶解于水，必要時(shí)加熱。調(diào)整pH使培養(yǎng)基為7.0±0.2,加入指示劑溴甲酚紫，分裝試管，115℃高壓滅菌30min。A.4.3試驗(yàn)方法挑取小量培養(yǎng)物接種于上述培養(yǎng)基中，37℃±1℃培養(yǎng)2d~5d,觀察指示劑變黃，表示產(chǎn)酸，為陽性；不變或變藍(lán)(紫)為陰性。A.5明膠液化A.5.1成分3DB32/T2583-2013名稱蛋白胨牛肉膏明膠A.5.2制法名稱蛋白胨牛肉膏氯化鈉碘液同A.2.2。酵母浸膏磷酸氫二鉀磷酸二氫鉀氯化鈉丙二酸鈉4DB32/T2583-2013A.7.3試驗(yàn)方法用新鮮的瓊脂培養(yǎng)物接種，于36℃±1℃培養(yǎng)48h,觀察結(jié)果。陽性者由綠色變?yōu)樗{(lán)色；培養(yǎng)基不A.8檸檬酸鹽利用氯化鈉A.8.2制法加熱溶解，調(diào)整pH至7.0±0.2,加入指示劑，分裝試管，121℃高壓滅菌20min。A.8.3試臉方法用瓊脂培養(yǎng)物接種整個(gè)斜面，在36℃±1℃培養(yǎng)7d,每天觀察結(jié)果。陽性者培養(yǎng)基變?yōu)榧t色，否A.9硝酸鹽還原A.9.1培養(yǎng)基A.9.1.1成分硝酸鉀蛋白胨加熱溶解，調(diào)整pH至7.0±0.2,分裝試管，每管約5mL,121℃高壓滅菌15min。A.9.2試劑甲液乙液甲萘胺0.1g二苯胺試劑A.9.3試驗(yàn)方法接種后在36℃±1℃培養(yǎng)2d~4d,加入甲液和乙液各一滴，觀察結(jié)果。若溶液變?yōu)榧t色、橙色、棕色為硝酸鹽還原陽性。若無紅色出現(xiàn)，可加1滴～2滴二苯胺試劑，如不呈藍(lán)色，也為硝酸鹽還原陽5A.10.1成分蛋白胨牛肉膏氯化鈉A.10.2制法各成分溶解于