流式細胞術(shù)培訓(xùn)課件

流式細胞術(shù)培訓(xùn)講座生物物理所蛋白質(zhì)功能研究平臺流式組流式細胞術(shù)培訓(xùn)1980.1以前：1421980.1—1990.1:94501990.1—2000.1:33459.2000.1—2005.1:288502005.1—2009.4.15:29495科技文獻數(shù)量增長的一個簡單統(tǒng)計美國國立生物技術(shù)信息中心

PUBMED查詢：檢索關(guān)鍵詞：flowcytometry結(jié)果：流式細胞術(shù)培訓(xùn)目錄（一）.流式細胞術(shù)的功能特點與應(yīng)用一.流式細胞儀的功能特點二.流式細胞術(shù)的應(yīng)用（二）.流式細胞儀原理簡要一.流體動力學(xué)聚焦二.熒光光信號檢測

三.細胞分選四.實例及數(shù)據(jù)分析

（三）.制備和設(shè)計流式樣本一.樣本制備和實驗流程 二.設(shè)計熒光染料組合的幾個注意事項

（四）.流式細胞術(shù)的新發(fā)展流式細胞術(shù)培訓(xùn)流式細胞術(shù)的功能特點與應(yīng)用流式細胞術(shù)培訓(xùn)（1）流式細胞儀的定義

流式細胞儀是指，使細胞（或其他粒子）以單個方式依次通過探測光束，采集細胞被光照時產(chǎn)生的各種信號，然后對信號進行處理，并能對多個參數(shù)進行關(guān)聯(lián)分析的一種儀器。一.流式細胞儀的功能特點流式細胞術(shù)培訓(xùn)（2）流式細胞儀與熒光顯微鏡類比熒光顯微鏡流式細胞儀視野,靜止,同時單個,流動,依次肉眼/CCDPMT多激發(fā)同時多激發(fā)(激光)一.流式細胞儀的功能特點流式細胞術(shù)培訓(xùn)

多通道（多參數(shù)）高通量 高靈敏度 定量 高精確度 細胞分選（3）流式細胞儀的功能特點流式細胞術(shù)培訓(xùn)（1）幾個著名的實際應(yīng)用：

HIV感染與病程動態(tài)監(jiān)測：輔助T淋巴細胞的絕對計數(shù)；

癌癥動態(tài)及治療方案：細胞DNA含量和增殖活性；

器官移植：交叉配型；

分選人類染色體，建立遺傳文庫（geneticlibraries）；

動物育種的性別選擇：分選含x或y染色體的精子；

人類體外受精；

造血干細胞和其他一大類干細胞各個分化層次鑒別；

海洋、環(huán)境微生物研究，發(fā)現(xiàn)未知種屬。二.流式細胞術(shù)的應(yīng)用流式細胞術(shù)培訓(xùn)原子0.1nm1nm10nm100nm1μm10μm100μm1mm氨基酸蛋白質(zhì)病毒支原體細菌紅細胞上皮細胞植物細胞電鏡光學(xué)顯微鏡人眼極限當(dāng)前流式細胞儀可測量顆粒大小最小約0.2μm（2）測量對象：顆粒尺度

（單細胞懸浮液）流式細胞術(shù)培訓(xùn)（3）可測量的細胞參數(shù)

細胞膜：表面糖分子、細胞膜流動性和通透性、膜融合和翻轉(zhuǎn)、膜脂質(zhì)構(gòu)成、細胞膜及線粒體膜電位等。細胞質(zhì)：（1）Ca2+、Na+、K+、H+（2）信號網(wǎng)絡(luò)蛋白、各種抗原、各類酶分子、細胞骨架蛋白、熒光蛋白（3）酶活、蛋白磷酸化、乙?；?、甲基化修飾等、核酸分析：DNA、RNA含量，DNA合成、降解、斷裂，區(qū)分核酸單、雙鏈，測量端粒長度、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、堿基構(gòu)成。染色單體分選。無需染色：大小，顆粒度，自發(fā)熒光，色素，絕對計數(shù)等流式細胞術(shù)培訓(xùn)流式細胞術(shù)培訓(xùn)經(jīng)驗性總結(jié)：細胞內(nèi)幾乎所有能夠被熒光染料標(biāo)記的成分或某種變化都可以用流式細胞儀進行檢測。流式細胞術(shù)培訓(xùn)流式細胞儀原理簡要流式細胞術(shù)培訓(xùn)一.流體動力學(xué)聚焦流動室流體動力學(xué)聚焦流速：10m/s最大40m/s——高通量20,000—200,000cell/S激光聚焦流式細胞術(shù)培訓(xùn)流式細胞術(shù)培訓(xùn)流體動力學(xué)聚焦的效果是，位于液流軸線上的細胞被依次排列成一條單細胞的隊列，沿著一條極為精確而穩(wěn)定的軌道運動。流式細胞術(shù)培訓(xùn)二.熒光檢測探測光路聚焦（1）空間立體激發(fā)結(jié)構(gòu)三軸垂直：高精確度—2%的熒光差別流式細胞術(shù)培訓(xùn)（2）散射光信號的產(chǎn)生前向散射光：大小側(cè)向散射光：顆粒度流式細胞術(shù)培訓(xùn)FL-AFL-HFL-W面積（A）：熒光總量高度（H）：最大熒光強度寬度（W）：細胞直徑（3）PMT：光信號到電脈沖信號高靈敏度—50MESF流式細胞術(shù)培訓(xùn)（4）光學(xué)鏡片流式細胞術(shù)培訓(xùn)（5）各色熒光信號分離二色反光鏡

123帶通濾光片光電倍增管激光束細胞收集透鏡前向散射光側(cè)向散射光，熒光多通道（多參數(shù)）流式細胞術(shù)培訓(xùn)另一個參數(shù)：時間—連續(xù)過程的檢測多激光激發(fā)：多通道（多參數(shù)）—6桿激光，17個熒光通道流式細胞術(shù)培訓(xùn)八角反射式信號收集系統(tǒng)（6）更先進的光信號收集和分離方式提高的靈敏度—(二色反光鏡)反射~透射:95%~80%流式細胞術(shù)培訓(xùn)二.細胞分選原理●高通量●高純度：可達99.9%●可分選極少含量的細胞●多種分選方式流式細胞術(shù)培訓(xùn)FACSVantageDiva的模擬四路分選。流式細胞術(shù)培訓(xùn)四.實例與數(shù)據(jù)分析（1）紅細胞裂解后的外周血細胞檢測成分：樣本中的細胞有單核細胞，淋巴細胞，粒細胞染色：單克隆抗體標(biāo)記

1）CD14存在于單核細胞表面。熒光染料：

Phycoerythrin（PE）

2）CD45以不同的密度存在于所有白細胞表面。（淋巴細胞>單核細胞>粒細胞）熒光染料：fluoresceinisothiocyanate(FITC).信號收集：FSC，SSC，PE/FITC雙熒光信號。細胞數(shù)：10，000。流式細胞術(shù)培訓(xùn)二維圖：散點圖CD45FITC(log)R1=單核細胞(CD14+ve)R2=淋巴細胞(CD45>單核細胞)R3=粒細胞(CD45<單核細胞)CD14PE(log)前向散射光(linear)側(cè)向散射光(linear)流式細胞術(shù)培訓(xùn)CD14PECD45FITC細胞數(shù)細胞數(shù)CD45FITCCD14PE一維圖：直方圖對比：雙參數(shù)的二維圖能提供更多信息流式細胞術(shù)培訓(xùn)（2）DNA含量檢測高精確性—以及極小的儀器誤差（CV）！BDFASCalibur流式細胞術(shù)培訓(xùn)質(zhì)量控制：變異系數(shù)（CV）：流式細胞儀的“分辨率”。Tip：獲取高質(zhì)量數(shù)據(jù)的關(guān)鍵在于獲得小的CV值。流式細胞術(shù)培訓(xùn)（3）用流式細胞儀發(fā)現(xiàn)的側(cè)群細胞（SPCell）流式細胞術(shù)培訓(xùn)Hoechst33258ATChromomycinA3GC2456X89-127recip9-221314151617Y1820192221Ph1/313(4)染色體核型流式細胞術(shù)培訓(xùn)制備和設(shè)計流式樣本流式細胞術(shù)培訓(xùn)制取單細胞懸浮液熒光染色上機檢測數(shù)據(jù)分析機械破碎，酶解消化，化學(xué)解聚—去除碎步與團塊細胞吸收的熒光染料與其目標(biāo)分子含量成正比，熒光信號強度與吸收的熒光染料分子成正比儀器校準(zhǔn)和優(yōu)化結(jié)合生理現(xiàn)象分析數(shù)據(jù)實驗流程流式細胞術(shù)培訓(xùn)熒光染色設(shè)計的幾個原則了解儀器的激光/濾光片的組合匹配熒光亮度與最低密度的目標(biāo)分子了解所用熒光染料的激發(fā)和發(fā)射譜減小熒光光譜重疊使用多桿激光，但需避免多重激發(fā)小心使用組合染料（tandemdyes）設(shè)定合適的對照樣本（調(diào)節(jié)熒光補償?shù)臉颖荆┝魇郊毎g(shù)培訓(xùn)（1）熒光補償發(fā)射光譜重疊帶來干擾，需要將其進行補償流式細胞術(shù)培訓(xùn)JerryBarnhart流式細胞術(shù)培訓(xùn)CD45FITC信號“滲漏”到PE探測通道，CD4PE信號微弱的細胞不能被區(qū)分出來CD45PercP信號不“滲漏”到PE探測通道，CD4PE信號微弱的細胞被識別出來。JerryBarnhart流式細胞術(shù)培訓(xùn)（2）了解染料光譜，合理選擇組合多種熒光流式細胞術(shù)培訓(xùn)（3）選擇多桿激光，但注意避免雙重激發(fā)561nm激發(fā)光可更好的激發(fā)PE，但不能激發(fā)FITC，因此可避免熒光補償。JerryBarnhart流式細胞術(shù)培訓(xùn)CD19FITC22.5小時AmCyan+AmCyan-多重激發(fā)導(dǎo)致熒光信號“滲漏”，降低分辨力AmCyan：紫光及藍光激發(fā)FITC：藍光激發(fā)JerryBarnhart流式細胞術(shù)培訓(xùn)（4）使用組合染料需考慮其技術(shù)限制PECD8PE-Cy7CD3PE-Cy50小時2小時22.5小時(AlanStall&KenDavis)不穩(wěn)定性流式細胞術(shù)培訓(xùn)APC通道假陽性無假陽性PE通道假陽性PE通道假陽性無假陽性APC通道假陽性假陽性影響-APC-CY7+PE-Cy7+APC-CY7-PE-Cy7（JerryBarnhart）+APC-CY7+PE-Cy7流式細胞術(shù)培訓(xùn)流式細胞術(shù)的新進展流式細胞術(shù)培訓(xùn)一.流式細胞術(shù)法發(fā)展?fàn)顩r儀器技術(shù)：90年代后期，現(xiàn)在已相對成熟；試劑，染料：取得很大進展，目前類型已非常豐富，但商業(yè)化普及有所不足；數(shù)據(jù)分析技術(shù)：遠滯后于前兩者，可能成為將來流式技術(shù)最大的進步。流式細胞術(shù)培訓(xùn)二.新應(yīng)用數(shù)據(jù)分析技術(shù)：高內(nèi)容的多參數(shù)空間要求更有效的聚類算法；

k-均值聚類--混合高斯模型特異性磷酸化蛋白多色檢測試劑。

胞內(nèi)及表面染色：如MAPK，JNK，Erk，JAK/Stat等信號通路動力學(xué)，測繪信號網(wǎng)絡(luò)；基本機制研究；相關(guān)疾病診斷與治療。在當(dāng)今系統(tǒng)生物學(xué)時代，了解蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)，多參數(shù)流式細胞儀可成為一種關(guān)鍵性的工具。流式細胞術(shù)培訓(xùn)多參數(shù)流式細胞術(shù)改變了對抗原特異性T細胞反應(yīng)的認識。

多維的免疫關(guān)聯(lián)性只能由多參數(shù)流式細胞術(shù)揭示。量子點染料技術(shù)得到大量應(yīng)用。量子點染料與傳統(tǒng)抗體交聯(lián)：高亮，發(fā)射峰狹窄，更好的染色分辨率，更大的實驗設(shè)計空間。Beckman-Coulter的新流式細胞儀-2009年下半年。

流式細胞術(shù)培訓(xùn)謝謝流式細胞術(shù)培訓(xùn)BDFACSCalibur流式細胞術(shù)培訓(xùn)BDFACSAriaII流式細胞術(shù)培訓(xùn)BDFACSVantageDiva流式細胞術(shù)培訓(xùn)BeckMan-CoulterMoFlo?XDP

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